مقدمه
حفره دهان بیش از 200 گونه میکروبی دارد. به همین دلیل، موارد بروز عفونت‌های باکتریایی و قارچی در دهان بالاست. گونه‌های استرپتوکوکوس، شایع‌ترین فلور باکتریایی در بزاق، زبان و لثه است [1]. گونه‌های کاندیدا، بخشی از فلور قارچی همزیست حفره دهان می‌باشند که میزان حمل دهانی آن‌ها در گروه‌های سنی مختلف و شرایط زمینه‌ای مختلف، متفاوت است. از جمله این شرایط مستعدکننده، می‌توان به بیماری‌ها یا عفونت‌های سرکوب‌کننده سیستم ایمنی مانند، ویروس نقص سیستم ایمنی انسان، دیابت ملیتوس، کورتیکواستروئید درمانی طولانی ‌مدت، دریافت عضو پیوندی و شیمی‌درمانی علیه سرطان اشاره کرد. در این شرایط، ضعف سیستم ایمنی موجب می‌شود مخمرهای کاندیدایی موجود در بدن فرصت تکثیر یافته و ایجاد بیماری کنند. بیشترین میزان حمل دهانی کاندیدا در کودکان سالم، سالمندان و بیماران مبتلا به ایدز گزارش می‌شود [2].
کاندیدیازیس دهانی، اغلب توسط کاندیدا آلبیکنس، کاندیدا گلابراتا، کاندیدا تروپیکالیس، کاندیدا دابلینینسیس، کاندیدا پاراپسیلوزیس و کاندیدا کروزئی ایجاد می‌شود [3]. در سال‌های اخیر، کلونیزاسیون دهانی با کاندیدا کروزئی به عنوان عوامل مخمری نوظهور به‌ویژه در بیماران ایدزی شایع شده است و حدود 20 درصد از مخمرهای جدا شده از کشت بیماران ایدزی را تشکیل می‌دهد [4]. با وجود درمان‌های وسیع ضد قارچی و ضد ویروسی موثر که منجر به بهبود سیستم ایمنی در بیماران ایدزی می شود، متاسفانه از مشکلات اصلی در درمان بیماران ایدزی مبتلا به کاندیدیازیس دهانی، بروز مقاومت‌های دارویی است که به دلیل طولانی بودن دوره درمان، عود مکرر و عدم وجود داروهای متنوع ضد قارچی در بازار می‌باشد. مطالعات مختلف نشان دادند، کاندیدا کروزئی به عنوان یک گونه کاندیدایی شایع دهانی در این دسته از بیماران، نسبت به برخی داروهای ضد قارچی مانند آزول‌ها مقاومت نشان داده که این امر منتج به شکست درمانی در بیماران تحت درمان شده است [5]. 
بنابراین، استفاده از ترکیبات طبیعی ضد میکروبی در درمان بیماری‌ها از گذشته‌های دور متداول بوده و دارای سابقه چندهزار ساله است. امروزه، استفاده از داروهای گیاهی و ترکیبات خالص آن‌ها در درمان برخی از بیماری‌های عفونی، افقی را برای ما گشوده است. هم‌اکنون تحقیقات گسترده‌ای در ایران و جهان بر روی ترکیبات طبیعی ضد قارچی در حال انجام است [6]. یکی از این ترکیبات خالص، اوژنول (4- آلیل 2- متوکسی‌فنیل) بوده که یک مشتق آلیلی از گایاکول است. این ترکیب، یکی از اعضای خانواده فنیل‌پروپانوئید بوده که وزن مولکولی آن 164/20 گرم بر مول است. این ترکیب در آب، ایجاد محلولی چسبنده می‌کند، درحالی‌که در حلال‌های آلی به‌خوبی حل می‌شود. گیاهان میخک، دارچین و جوز هندی حاوی مقادیر قابل‌توجّهی از این ترکیب هستند [7]. اوژنول در شرایط آزمایشگاهی علیه مخمّرها، قارچ‌های رشته‌ای رنگی و شفاف و قارچ‌های مولّد مایکوتوکسین موثر است و اثرات مهارکنندگی آن بر روی گونه‌های مختلف کاندیدا در مطالعات قبلی به اثبات رسیده است [8, 9]. مطابق بررسی‌ها، اوژنول علیه مخمرهای کاندیدایی در دامنه بین 350 تا 500 میکروگرم در میلی‌لیتر، اثر ضدقارچی دارد [10]. محققین نشان دادند، ترکیب مواد خالص گیاهی با داروهای شیمیایی ضد قارچی، قادر خواهد بود با کاستن دوز داروهای شیمیایی، کاهش عوارض جانبی و ایجاد اثرات سینرژیستی یا افزایشی، به درمان بیماران مبتلا به کاندیدیازیس کمک قابل توجهی کند [11].
تاکنون، مطالعه‌ای در زمینۀ اثرات نکروزی و آپوپتوزی ترکیب اوژنول با فلوکونازول بر روی گونه‌های کاندیدا صورت نگرفته است. بنابراین، در این مطالعه سعی شده است تا اثرات سینرژیستی ضد قارچی، نکروزی و آپوپتوزی ماده طبیعی اوژنول در ترکیب با داروی شیمیایی فلوکونازول بر علیه سویه‌های کاندیدایی جدا شده از دهان بیماران ایدزی، مورد ارزیابی قرار گیرد تا نتایج آن بتواند به رفع نیازهای علمی کشور، تجاری‌سازی و ساخت فرآورده‌های دارویی با تکیه بر ترکیبات طبیعی موجود در ایران برای درمان کاندیدیازیس دهانی در انسان کمک شایانی نماید.
مواد و روش‌ها
جدایه‌های قارچی و شناسایی آن‌ها
این مطالعه، یک تحقیق تجربی - آزمایشگاهی است. در این پژوهش، 10 سویه بالینی کاندیدا کروزئی (جدا شده از دهان بیماران ) و یک سویه استاندارد کاندیدا کروزئی مورد استفاده قرار گرفت. همه جدایه‌های مخمری در محیط سابورو دکستروز آگار کشت داده شده و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 تا 3 روز گرمخانه‌گذاری شدند. تمامی جدایه‌های کاندیدا کروزئی با استفاده از روش‌های استاندارد قارچ‌شناسی نظیر کشت در کروم آگار و آزمایشات جذب و تخمیر قند با استفاده از کیت RAPIDTMTM تعیین هویت شدند.
ترکیبات ضد قارچی و تهیه رقت‌های مختلف آن‌ها
در این پژوهش، یک ترکیب طبیعی گیاهی به ‌نام ‌اوژنول و یک داروی ضد قارچی شیمیایی به نام‌ فلوکونازول مورد استفاده قرار گرفتند. برای آزمایش، رقت‌های دو برابر اوژنول با دامنۀ 9/76 تا 5000 میکروگرم در میلی‌لیتر و رقت‌های دو برابر فلوکونازول با دامنۀ 0/031 تا 512 میکروگرم در میلی‌لیتر تهیه شدند. به ترتیب، برای تهیۀ رقت‌های اوژنول و فلوکونازول، از ایزوپروپانول 70 درجه (Merck) و آب مقطر استریل استفاده شد. 
تهیه سوسپانسیون مخمری
برای تهیه سوسپانسیون استاندارد مخمری، ابتدا جدایه‌های کاندیدا کروزئی در محیط سابورو دکستروز آگار کشت داده شدند. به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه‌گذاری شدند. سوسپانسیون تلقیحی از طریق برداشت 5 کلنی (با قطری حدود 1 میلی‌متر) از کشت تازه در داخل 10 میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی (سالین 0/85 درصد) آماده شد. سوسپانسیون فوق به مدت 15ثانیه ورتکس شده و میزان تراکم سلولی با روش مک فارلند (0/5) تعیین شد؛ به طوری که در نهایت، مقدار سلول‌های مخمری، 103×0/5 سلول در هر میلی‌لیتر تنظیم شد [10]. 
آزمایش حساسیت ضد قارچی
فعالیت ضدکاندیدایی ترکیبات تحت مطالعه، با روش رقت‌سازی سریالی در محیط مایع (براث میکرودایلوسیون) مطابق با روش پیشنهادی CLSI تحت عنوان M27-A2انجام شد [12]. در این روش، با استفاده از محیط (Merck) RPMI1640 حاوی گلوتامین و گلوکز به همراه بافر MOPS با pH:7، حداقل غلظت مهاری تعیین شد. از پلیت‌های 96 خانه‌ای پلی استیرنی ته گرد استریل برای انجام آزمایش استفاده شد، به طوری که در هر چاهک،100 میکرولیتر از رقت‌های ترکیبات تحت آزمایش و 100 میکرولیتر سوسپانسیون مخمری اضافه شد. برای هر مخمر، چاهک کنترل منفی و چاهک کنترل مثبت در نظر گرفته شد. هر آزمایش دو مرتبه به صورت مجزا تکرار شد.
میزان حداقل غلظت مهارکنندگی پس از 24 ساعت گرمخانه‌گذاری میکروپلیت‌ها در دمای 35 درجه سانتی‌گراد با الایزا ریدر تعیین شد. برای تعیین حداقل غلظت کشندگی ، مقدار 100 میکرولیتر از غلظتی که به عنوان MIC تعیین گردیده و همچنین چند غلظت بالاتر از MIC که با دید ماکروسکوپی هم شفاف به نظر می‌رسید، بر روی محیط سابورو دکستروز آگار کشت داده شد و در انکوباتور 35 درجه سانتی‌گراد بعد از 24 ساعت، مورد بررسی قرار گرفت. حداقل غلظتی که مانع رشد گونه‌های کاندیدا شده بودند، به عنوان MFC در نظر گرفته شدند. ملاک حساسیت یا مقاومت برای فلوکونازول توسط CLSI پیشنهاد شده است [12]: 8 MIC≥ میکروگرم در میلی‌لیتر به عنوان حساس، 32 -16= MIC میکروگرم در میلی‌لیتر به عنوان حساس وابسته به دوز و 64 MIC≤ میکروگرم در میلی‌لیتر به عنوان مقاوم شناخته می‌شوند.
آزمایش تعیین سینرژی چکربورد 
آزمایش سینرژی چکربورد برای تعیین شاخص غلظت بازدارنده جزئی انجام شد [13]. بنابراین، رقت‌های سریالی دوتایی از اوژنول و فلوکونازول تهیه شدند. میزان 50 میکرولیتر از هر رقت اوژنول و فلوکونازول به هر گوده پلیت 96 خانه اضافه شدند. همچنین، 100 میکرولیتر از سوسپانسیون مخمری 103×0/5 سلول در هر میلی‌لیتر به هر گوده اضافه شد و در دمای 35 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت گرم‌خانه‌گذاری شد. فرمول محاسبه میزان FICبدین ترتیب است:
 FICدارو =«MIC داروی ترکیبی» / «MIC دارو به تنهایی»
میزان سینرژیستی داروها با جمع FIC اوژنول و FIC فلوکونازول به‌دست آمد. تفسیر آزمایش چکربورد به شرح ذیل می‌باشد: 5/FICI≤0 (اثر سینرژیستی)، 0/5 >FICI>1 , FICI,(اثر افزایشی). 
بررسی نکروز و آپوپتوز به روش فلوسایتومتری
برای تعیین درصد سلول‌های نکروزه و آپوپتوزه در جمعیت مخمرهای تیمار شده با داروها و مقایسه آن با جمعیت کنترل، رنگ‌آمیزی مخمرها با دو رنگ Annexin-V و پروپیدیوم یدید (PI) با استفاده از کیت تجاری Annexin-V-FLOUS staining Kit انجام گرفت. بدین منظور، سلول‌های جدایه‌های استاندارد کاندیدا کروزئی (106× 2 سلول در هر میلی‌لیتر) در سابورو دکستروز براث حاوی اوژنول و فلوکونازول به مدت 24 ساعت در دمای 3 0 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. سلول‌های مخمری به روش سانتریفیوژ برداشت شده و با بافر فسفات پتاسیم (0/1 مولار) شستشو شدند. آزمایش آنکسین،PI/V مطابق پروتکل کیت رنگ‌آمیزی با استفاده از 5 میکروگرم آنکسین Vو 5 میکروگرم PI در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه انجام شد. سپس، میزان آپوپتوز سلول‌های کاندیدایی با استفاده از یک دستگاه فلوسایتومتر مدل C6 آنالیز شد. در این آنالیز، سلول‌هایی که طی مرگ برنامه‌ریزی‌ شده، غشای خود را از دست داده‌اند، فسفاتیدیل سرین را از سطح داخلی به سطح خارجی غشاء منتقل کرده و آنکسین V به فسفاتیدیل سرین موجود در سطح خارجی سلول متصل شده و توسط فلوسایتومتری تشخیص داده شد. PI متصله به DNA قطعه‌قطعۀ شده هستۀ سلول‌های مرده نیز با آزمایش فلوسایتومتری مشخص شد [14].
آنالیز آماری
برای آنالیز آماری نتایج پژوهش حاضر، از آزمون‌های آماری آزمون تی برای مقایسۀ میانگین گروه‌های مورد نظر و آنالیز واریانس برای یافتن بیشترین و کمترین تأثیر مواد تحت مطالعه در تمام گروه‌ها استفاده شد. مقدار 05/P˂0 از نظر آماری معنا‌دار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
آزمایش حساسیت ضد قارچی
مقادیر MICو MFC اوژنول و فلوکونازول علیه جدایه‌های بالینی کاندیدا کروزئی در جدول شماره 1 ارایه شده است.


دامنه مقدار مخمرهای MIC کاندیدا کروزئی برای اوژنول از 312/5 تا 1250 میکروگرم در میلی‌لیتر و برای فلوکونازول از 8 تا 128 میکروگرم در میلی‌لیتر بودند. حدود 81/8 درصد سویه‌های کاندیدا کروزئی آزمایش شده به فلوکونازول مقاومت نشان دادند. تنها 18/2 درصد به فلوکونازول حساس بودند. میانگین هندسی مقادیر MFC اوژنول و فلوکونازول به ترتیب 1173/66 و 120/2 میکروگرم در میلی‌لیتر تعیین شدند. 
آزمایش چکربورد
مقادیر شاخص FICI برای اوژنول و فلوکونازول علیه سویه‌های مختلف کاندیدا کروزئی در جدول شماره 2 نشان داده شده است.


دامنۀ شاخص FICI برای ترکیب اوژنول + فلوکونازول بین 0/25 تا 0/75 برای مخمرها محاسبه شد. ترکیب اوژنول با فلوکونازول بر روی 90/9 درصد جدایه‌های بالینی کاندیدا کروزئی، دارای اثر سینرژیستی بوده است. آنالیز آماری آزمایش چکربورد، یک اثر معنادار سینرژیستی بین اوژنول و فلوکونازول بر علیه جدایه‌های کاندیدای تحت مطالعه نشان داد (05/P˂0). نتیجه آزمایش ثابت کرد، اوژنول قادر است تا 81/81 درصد، میزان MIC فلوکونازول را در مهار رشد کاندیدا کروزئی کاهش دهد. در این مطالعه، هیچ اثر آنتاگونیستی بین اوژنول و فلوکونازول مشاهده نشده است.
نتایج آزمایش فلوسایتومتری
همان‌طور که در هیستوگرام‌ها مشاهده می‌شود (تصویر شماره 1):

ناحیه Q1: سلّول‌های نکروزی با ویژگی PI+ Annexin-V-
ناحیه Q2: سلّول‌ها در مرحلۀ آپوپتوز نهایی با ویژگی PI+ Annexin-V+
ناحیه Q3: سلّول‌ها در مرحلۀ آپوپتوز اولیه با ویژگی P‏I- Annexin-V+
ناحیه Q4: سلّول‌های سالم با ویژگی- PI - Annexin-V. 
نتایج آزمایش فلوسایتومتری نشان دادند، ترکیب اوژنول + فلوکونازول دارای اثر نکروزی معناداری بر روی جدایه‌های بالینی کاندیدا کروزئی در مقایسه با گروه کنترل بودند (05/P˂0)، در حالی‌که اثرات آپوپتوز اولیه و نهایی بر این جدایه مخمری، کم بوده است (جدول شماره 3). 


بحث
یکی از بزرگترین موانع برای غلبه بر عفونت‌های کاندیدایی دهان، استفاده از درمان با یک داروی ضد قارچی بوده که منجر به ظهور مقاومت در مخمرهای بیماری‌زا می شود [15]. بنابراین، یافتن ترکیبات طبیعی ایمن و موثر همراه با عوارض جانبی اندک، بسیار حائز اهمیت است. این مطالعه با اهداف سنجش اثر سینرژیستی ضدکاندیدایی، یکی از ترکیبات فنیل پروپانوئیدی موجود در اسانس روغنی برخی از گیاهان دارویی به نام اوژنول در ترکیب با فلوکونازول و تعیین اثر نکروزی وآپوپتوزی آن‌ها علیه جدایه‌های بالینی کاندیدا کروزئی انجام شد.
 در این پژوهش، میانگین MIC فلوکونازول بر علیه جدایه‌های کاندیدا کروزئی حدود 60/1 میکروگرم در میلی‌لیتر بود. از بین تمامی مخمرهای آزمایش شده، حدود 81/8 درصد آن‌ها به فلوکونازول مقاومت معنادار نشان دادند. نتایج تحقیقات سایر پژوهشگران ثابت کرد، سویه‌های کاندیدا کروزئی در مقادیر MIC بین 50 و 179 میکروگرم در میلی لیتر فلوکونازول، مقاومت بالایی را نشان دادند که با این یافته‌ها تطابق دارند [16 ،13]. امروزه، اکثر داروهای ضد قارچی استفاده شده به صورت موضعی و نظام مند از دسته آزول‌ها هستند. از بین آزول‌ها، فلوکونازول بیشتر در درمان عفونت‌های کاندیدایی استفاده می‌شود. این داروی ضد قارچی شیمیایی با مهار تولید ارگوسترول در غشای پلاسمایی گونه‌های کاندیدا موجب مهار رشد سلول قارچی می‌شود، اما بیشتر سویه‌های کاندیدا کروزئی به طور ذاتی مقاوم به فلوکونازول هستند. بنابراین، استفاده از ترکیبات با فعالیت بالای مهارکنندگی برای درمان عفونت‌های ناشی از این گونه کاندیدایی ضروری است.
نتایج حاصله از مطالعه موردنظر نشان داد، ترکیب طبیعی اوژنول با دامنه MIC از 312/5 تا 1250 میکروگرم در میلی‌لیتر دارای اثر ضد قارچی علیه جدایه‌های مقاوم کاندیدا کروزئی است. در واقع، با افزایش غلظت اوژنول در محیط آزمایش، رشد جدایه‌های کاندیدایی بتدریج کاهش یافته بود. سایر محققین هم فعالیت ضد قارچی اوژنول بر علیه گونه‌های کاندیدا را به‌ خوبی نشان داده‌اند. از جمله، احمد و همکاران [17] نشان دادند، اوژنول در غلظت‌های 475-500 میکروگرم در میلی‌لیتر یک ترکیب طبیعی ضد قارچی موثر بر علیه کاندیدا کروزئی است. در مطالعه انجام شده توسط مارکوس آریاس و همکاران [9]، اوژنول در غلظت‌های 450-500 میکروگرم در میلی‌لیتر موجب مهار رشد گونه‌های مختلف کاندیدا، به‌ویژه کاندیدا کروزئی شده بود. گالوچی و همکاران [15] گزارش کردند، اوژنول با مقادیر MIC و MFC به ترتیب 880 و 1090 میکروگرم در میلی‌لیتر موجب مهار رشد و مرگ سویه‌های کاندیدا کروزئی می شود. چندین مطالعه مانند مطالعات بنیس و همکاران [18] و براگا و همکاران [19]، مکانیسم عمل اوژنول بر علیه قارچ‌ها را مورد بررسی قرار دادند. این محققین با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نشان دادند، اوژنول سبب تغییرات مورفولوژیکی فوق ساختاری در غشای گونه‌های کاندیدا می‌شود. در این مورد، متعاقب تیمار سلول‌های مخمری با اوژنول به میزان 500 میکروگرم در میلی‌لیتر، افزایش معناداری در تعداد مخمرهای کاندیدایی آسیب‌دیده با سطوح خشن و چروکیده مشاهده شد. محققین پیشنهاد دادند، اوژنول به دلیل خاصیت لیپوفیلیکی می‌تواند به داخل زنجیره‌های آسیل چرب غشای دو لایه‌ای پلاسمالمای مخمر نفوذ کرده و موجب تغییر در نفوذپذیری غشای سلول شود [20]. سایر محققین نیز ثابت کردند، اوژنول در غلظت 500 میکروگرم در میلی‌لیتر موجب مهار فعالیت H+-ATPase گونه‌های کاندیدا، مسیر انتقال یون و خروج +H تحریک شده توسط گلوکز می‌شود [21]. 
 تلفیق مولکول‌های با مکانیسم عمل متفاوت، یکی از استراتژی‌های خوب برای درمان ترکیبی بیماری‌های عفونی است، زیرا کاهش عوارض جانبی، سمی بودن و دوز کلی داروها را در پی خواهد داشت. در مطالعه انجام شده، مقادیر FICI ترکیب اوژنول و فلوکونازول، برای جدایه‌های کاندیدا کروزئی بین 0/25 تا 0/75 به دست آمده است. بنابراین، یک کاهش معناداری (81/81 درصد) در میزان MIC، بعد از ترکیب اوژنول با فلوکونازول مشاهده شد. اثرات سینرژیستی در 90/9 درصد از جدایه‌های کاندیدا کروزئی دیده شدند. ترکیبات موجود در اسانس‌های روغنی قادر هستند در فعالیت‌های سینرژیستی، افزایشی و آنتاگونیستی تاثیرگذار باشند. اثرات سینرژیستی اوژنول و داروهای ضد قارچی در مطالعات گذشته ارزیابی شده‌اند. در تطابق با این یافته‌ها، احمد و همکاران [13] نشان دادند، اوژنول و متیل اوژنول در ترکیب با فلوکونازول با مقادیر FICI به ترتیب 0/31-0/55 و 0/24-0/58 دارای اثرات سینرژیستی بر روی گونه‌های کاندیدا بودند. محققین دیگر نیز اثرات سینرژیستی ترکیب اوژنول با فلوکونازول [22]، اوژنول با آمفوتریسین بی [23] و اوژنول با نیستاتین [11] را گزارش کردند. نقش ترکیبات اصلی اسانس‌های روغنی همچون اوژنول در چنین تداخلاتی به طور کامل مطالعه نشده است. می‌توان حدس زد، اوژنول با غشای پلاسمایی سلول قارچی تداخل نموده و نفوذ سایر داروهای ضد قارچی مانند آزول‌ها را به داخل سلول تسهیل می کند.
 در این بررسی، آزمایش فلوسایتومتری نشان داد، ترکیب اوژنول + فلوکونازول دارای اثر نکروزی زیاد و به میزان کمتر اثرات آپوپتوز اولیه و نهایی بر جدایه‌های بالینی کاندیدا کروزئی می‌باشد. طبق بررسی‌های وسیع انجام شده در این پژوهش، تاکنون هیچ مطالعه‌ای در زمینه اثرات سینرژیستی نکروزی و آپوپتوزی اوژنول با داروهای ضد قارچی انجام نشده است. این نتایج، اولین یافته آزمایشگاهی گزارش شده در زمینه درمان ترکیبی می‌باشد. البته، گزارشات کمی در مورد اثرات نکروزی و آپوپتوزی اوژنول و مشتقات‌اش به تنهایی بر روی گونه‌های کاندیدا وجود دارند. لون و همکاران [24] نشان دادند، مشتقات اوژنول می‌توانند از مسیر متاکاسپاز موجب القای نکروز و آپوپتوز سلول‌های کاندیدا شوند. این محققین ثابت کردند، اوژنول به واسطۀ آسیب DNA، دپولاریزاسیون میتوکندری و کاهش در فعالیت سیتوکرومC اکسیداز موجب نکروز مخمرها می‌شود. در مطالعه راجا و همکاران [25]، اوژنول سبب نکروز و آپوپتوز سلول‌های کاندیدا از طریق کاهش در بیوسنتز ارگوسترول شده است. به‌طور کلی، فرایندهای آپوپتوز و نکروز می‌توانند توسط محرک‌های داخلی و خارجی متفاوتی القا شوند و القای آن‌ها به‌ویژه در سلول‌های مخمری می‌تواند به عنوان یک مدل مناسب برای پایش عوامل ضد قارچی جدید و درمان بیماران مبتلا به عفونت‌های قارچی در نظر گرفته شود [26]. 
نتیجه‌گیری
این مطالعه نشان می دهد، اوژنول یک مونوترپن طبیعی با فعالیت ضد قارچی موثر بر علیه جدایه‌های دهانی کاندیدا کروزئی مقاوم و حساس به فلوکونازول می‌باشد. ترکیب اوژنول با فلوکونازول یک اثر سینرژیستی قوی را نشان دادند که با کاهش معنادار حداقل دوز فلوکونازول همراه بوده است. اوژنول در ترکیب با فلوکونازول دارای اثرات سینرژیستی معناداری در ایجاد نکروز مخمرهای تحت مطالعه بوده است. بنابراین، ترکیب یک ماده طبیعی مانند اوژنول با یک داروی شیمیایی مانند فلوکونازول می‌تواند هم اثر داروی شیمیایی را افزایش داده و هم دوز داروی شیمیایی را کاهش دهد که خود منجر به کاستن عوارض جانبی داروی شیمیایی می‌شود. طبق نتایج این مطالعه، درمان ترکیبی می‌تواند یک رهیافت درمانی مناسب در موارد شکست درمانی و مقاومت به داروهای ضد قارچی در بیماران ایدزی مبتلا به کاندیدیازیس دهانی باشد. 

ملاحظات اخلاقی
 پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه، طبق نامه تاییدیه به شماره 9055/20/98 به تاریخ 01/02/1399 ، مورد تایید کمیته اخلاق دانشگاهی قرار گرفته است.

حامی مالی
این بررسی در قالب طرح پژوهشی مصوب دانشگاه تخصصی فناوری‌های نوین آمل انجام شده است. در سال 1399، نمونه‌برداری از دهان بیماران HIV+ مراجعه کننده به بیمارستان امام خمینی دانشگاه علوم پزشکی تهران و آزمایشات در مرکز قارچ‌شناسی دانشگاه تخصصی فناوری‌های نوین دانشگاه آمل انجام شد.

مشارکت نویسندگان
هر سه نویسنده در طراحی، اجرا و نگارش همه بخش‌های پژوهش حاضر مشارکت داشته‌اند.

تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
 

Refrences
1.Shokri H. Immunology of fungal infections. Mashhad: Ferdowsi University of Mashhad (FUM Press); 2002. https://press.um.ac.ir/index.php?option=com_k2&view=item&id=939&lang=fa
2.Patil S, Majumdar B, Sarode SC, Sarode GS, Awan KH. Oropharyngeal candidosis in HIV-infectedpatients-An update. Frontiers in Microbiology. 2018; 9(10):980. [DOI:10.3389/fmicb.2018.00980]
3.Millsop JW, Fazel N. Oral candidiasis. Clinics in Dermatology. 2016; 34(4):487-94. [DOI:10.1016/j.clindermatol.2016.02.022] [PMID]
4.Hosain Pour A, Salari S, Ghasemi Nejad Almani P. [Oropharyngeal candidiasis in HIV/AIDS patients and non-HIV subjects in the Southeast of Iran (Persian)]. Current Medical Mycology. 2018; 4(4):1-6. [DOI:10.18502/cmm.4.4.379] [PMID] [PMCID]
5.Ksiezopolska E, Gabaldón T. Evolutionary emergence of drug resistance in candida opportunistic pathogens. Genes. 2018; 9(9):461. [DOI:10.3390/genes9090461] [PMID] [PMCID]
6.Salehi Surmaghi H. Medicinal plants and phytotherapy. Tehran: Donyaee Taghazie; 2006.
7.Shokri H. Natural compounds as novel antifungal agents. Amol: Amol University of Special Modern Technologies Press, 2018.
8.Abbaszadeh S, Sharifzadeh A, Shokri H, Khosravi AR, Abbaszadeh A. [Antifungal efficacy of thymol, carvacrol, eugenol and menthol as alternative agents to control the growth of food-relevant fungi (Persian)]. Journal de Mycologie Médicale. 2014; 24(2):e51-6. [DOI:10.1016/j.mycmed.2014.01.063] [PMID]
9.Marcos-Arias C, Eraso E, Madariaga L, Quindós G. In vitro activities of natural products against oral candida isolates from denture wearers. BMC Complementary and Alternative Medicine. 2011; 11:119. [DOI:10.1186/1472-6882-11-119] [PMID] [PMCID]
10.Sharifzadeh A, Shokri H. [In vitro synergy of eugenol on the antifungal effects of voriconazole against candida tropicalis and candida krusei strains isolated from the genital tract of mares (Persian)]. Equine Veterinary Journal. 2021; 53(1):94-101. [DOIi:10.1111/evj.13268] [PMID]
11.Da Silva ICG, Santos HBP, Cavalcanti YW, Nonaka CFW, de Sousa SA, de Castro RD. Antifungal activity of eugenol and its association with nystatin on candida albicans. Pesquisa Brasileira em Odontopediatria e Clinica Integrada. 2017; 17(1):e3235. [DOI:10.4034/PBOCI.2017.171.16]
12.Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, Approved Guideline second Edition. CLSI document M27-A3, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne PA, 2008.
13.Ahmad A, Khan A, Khan LA, Manzoor N. In vitro synergy of eugenol and methyleugenol with fluconazole against clinical candida isolates. Journal of Medical Microbiology. 2010; 59(Pt 10):1178-84. [DOI:10.1099/jmm.0.020693-0] [PMID]
14.Kolahi M, Tabandeh M, Saremy S, Hosseini S, Hashemitabar M. [The study of apoptotic effect of p-coumaric acid on breast cancer cells MCF-7 (Persian)]. Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences. 2016; 24 (3):211-21. https://www.sid.ir/en/journal/ViewPaper.aspx?id=514049
15.Gallucci MN, Carezzano ME, Oliva MM, Demo MS, Pizzolitto RP, Zunino MP, et al. In vitro activity of natural phenolic compounds against fluconazole-resistant candida species: A quantitative structure-activity relationship analysis. Journal of Applied Microbiology. 2014; 116(4):795-804. [DOI:10.1111/jam.12432] [PMID]
16.Sharifzadeh A, Khosravi AR, Shokri H, Shirzadi H.[ Potential effect of 2-isopropyl-5-methylphenol (thymol) alone and in combination with fluconazole against clinical isolates of candida albicans, C. glabrata and C. krusei (Persian)]. Journal de Mycologie Medicale. 2018; 28(2):294-9. [DOI:10.1016/j.mycmed.2018.04.002] [PMID]
17.Ahmad A, Wani MY, Khan A, Manzoor N, Molepo J. Synergistic Interactions of eugenol-tosylate and Its congeners with fluconazole against candida albicans. Plos One. 2015; 10(12):e0145053. [DOI:10.1371/journal.pone.0145053] [PMID] [PMCID]
18.Bennis S, Chami F, Chami N, Bouchikhi T, Remmal A. Surface alteration of saccharomyces cerevisiae induced by thymol and eugenol. Letters in Applied Microbiology. 2004; 38(6):454-8. [DOI:10.1111/j.1472-765X.2004.01511.x] [PMID]
19.Braga PC, Sasso MD, Culici M, Alfieri M. Eugenol and thymol, alone or in combination, induce morphological alterations in the envelope of candida albicans. Fitoterapia. 2007; 78(6):396-400. [DOI:10.1016/j.fitote.2007.02.022] [PMID]
20.Marchese A, Barbieri R, Coppo E, Orhan IE, Daglia M, Nabavi SF, et al. Antimicrobial activity of eugenol and essential oils containing eugenol: A mechanistic viewpoint. Critical Reviews in Microbiology. 2017; 43(6):668-89. [DOI:10.1080/1040841X.2017.1295225] [PMID]
21.Ahmad A, Khan A, Yousuf S, Khan LA, Manzoor N. Proton translocating ATPase mediated fungicidal activity of eugenol and thymol. Fitoterapia. 2010; 81(8):1157-62. [DOI:10.1016/j.fitote.2010.07.020] [PMID]
22.Pemmaraju SC, Pruthi PA, Prasad R, Pruthi V. Candida albicans biofilm inhibition by synergistic action of terpenes and fluconazole. Indian Journal of Experimental Biology. 2013; 51(11):1032-7. [PMID]
23.Alves JCO, Ferreira GF, Santos JR, Silva LCN, Rodrigues JFS, Neto WRN, et al. Eugenol induces phenotypic alterations and Increases the oxidative burst in cryptococcus. Frontiers in Microbiology. 2017; 8:2419. [DOI:10.3389/fmicb.2017.02419] [PMID] [PMCID]
24.Raja MRC, Srinivasan V, Selvaraj S, Mahapatra SK.Versatile and synergistic potential of eugenol: A review. Pharmaceutica Analytica Acta. 2015; 6(5):367. [DOI:10.4172/2153-2435.1000367]
25.Lone SA, Wani MY, Fru P, Ahmad A. Cellular apoptosis and necrosis as therapeutic targets for novel eugenol tosylate congeners against candida albicans. Scientific Reports. 2020; 10(1):1191. [DOI:10.1038/s41598-020-58256-4] [PMID] [PMCID]
26.Khan MS, Ahmad I, Cameotra SS. Phenyl aldehyde and propanoids exert multiple sites of action towards cell membrane and cell wall targeting ergosterol in candida albicans. AMB Express. 2013; 3(1):54. [DOI:10.1186/2191-0855-3-54] [PMID] [PMCID]