مقدمه
پروبیوتیک‌ها مکمل‌های غذایی متشکل از میکروارگانیسم‌های همسفره زنده هستند که پس از هضم، سلامتی میزبان را بهبود می‌بخشند و مزایای زیادی برای میزبان به همراه دارند [1، 2]. این میکروارگانیسم‌های زنده که به عنوان پروبیوتیک مصرف می‌شوند، کارایی درمانی زیادی برای انسان به همراه دارند، به طوری که در درمان اسهال ناشی از باکتری‌های پاتوژن روده‌ای مانند سندرم روده تحریک‌پذیر و سرطان‌های کولون نقش دارند [3، 4]. نقش پروبیوتیک‌ها در تعدیل پاسخ ایمنی می‌تواند به علت تأثیر این میکروارگانیسم‌های مفید زنده روی ترشح بعضی سایتوکین‌ها و بیان ژن‌های دخیل در ایمنی ذاتی باشد [5، 6]. 
نوع اثر پروبیوتیک، به تولید متابولیت‌های فعال از نظر بیوشیمیایی آن‌ها یا مولکول‌های موجود بر سطح این میکروارگانیسم‌ها یا اجزای مترشحه از آن‌ها بستگی دارد [7، 8]. به طور کلی، پروبیوتیک‌ها مواد مختلفی شامل اسید چرب با زنجیره کوتاه مثل استات، لاکتات، سوکسینات، بوتیرات، H2O2 و ترکیب‌های باکتریوسین تولید می‌کنند که هم روی باکتری‌های گرم مثبت و هم گرم منفی اثر می‌گذارند [10 ،9]. دفنسین‌ها پپتیدهای کاتیونی ضد‌میکروبی غنی از سیستئین هستند که به عنوان عضوی از سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی در نظر گرفته می‌شوند؛ چراکه قادر به فراخوانی مونوسیت‌ها و نوتروفیل‌ها هستند و در القای تولید سایتوکاین‌های مختلف نقش مؤثری دارند [11]. دفنسین‌ها توسط گروه‌های مختلفی از سلول‌ها از جمله نوتروفیل‌ها و سلول‌های ترشحی روده تولید می‌شوند و در in vitro فعالیت ضد‌میکروبی وسیعی را علیه باکتری‌های گرم منفی و مثبت، قارچ‌ها و ویروس‌ها انجام می‌دهند [12]. از میان این ترکیبات، به دلیل اهمیت بالای بتادفنسین 2 انسانی در تقویت سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی و اثرات آن روی نوتروفیل‌ها که خط اول دفاعی در سیستم ایمنی هستند، بسیار مورد مطالعه قرار می‌گیرد [12]. پرو بیوتیک‌ها ارگانیسم‌های زنده‌ای هستند که با تعدیل فلور میکروبی روده، اثرات مفیدی را بر روی سلامت میزبان اعمال می‌کنند و عموماً از منابع انسانی بوده و غیر بیماری‌زا محسوب می‌شوند. مکانیسم اثر پروبیوتیک‌ها کاملاً شناخته‌شده نیست، ولی مکانیسم‌هایی برای توجیه اثرات پیشگیری‌کننده و درمانی آن‌ها در بیماری‌های انسان پیشنهاد شده است [13]. 
مطالعه‌ها نشان داده است که پروبیوتیک‌ها با تأثیر بر آنزیم‌های گوارشی حیوانات و انسان‌ها، مهار عوامـل سـرطان‌زا در داخـل بـدن و شـرایط آزمایشـگاهی، سرکوب موتاسیون‌ها و ترکیب القا‌کننده سرطان و تومورها در حیوانات آزمایشـگاهی نقـش مـؤثری در جهت مقابله با سرطان ایفا می‌کنند [15 ،14]. به طـور کلی ، سرطان یک بیماری نا‌متناجس ژنتیکی است که پس از بیماری‌های قلبی‌عروقـی دومـین علـت شایع مرگ‌و‌میر در جهان به شمار می‌رود. یکی از شایع‌ترین نوع سـرطان دسـتگاه گـوارش در ایران، سرطان روده بزرگ است که از نظر بروز در مردان ایرانی رتبه سوم و در زنان، رتبه چهارم را به خود اختصاص داده است [16]. در آزمایش‌های بـرون‌تنـی نشـان داده شـده که پروبیوتیک‌ها در سـرکوب زخم‌های نئوپلاسـتیک اولیه و تومورهـای سـرطانی روده بزرگ در مدل‌های موش نقش دارند [17]. هـمچنـین یکی از مکانیسم‌های عملکردی پروبیوتیک‌ها از جملـه لاکتوباسـیلوس‌ها، خاصـیت ضـد‌تکثیری سـلول‌هـا‌ی سرطانی از جملـه سـرطان کولـون بـا القـای آپوپتـوز است [18]. بنابراین با پروبیوتیک‌درمانی سرطان، می‌توان با دو مکانیسم رشد سرطان را مهار کرد. اول با مهار مستقیم رشد باکتری‌های پاتوژن‌ها توسط خود پروبیوتیک‌ها و دوم مهار غیرمستقیم با تحریک ترشح بتادفنسین و پپتید‌های ضد‌میکروبی توسط سلول‌های انسانی [19]. 
Bax یک ژن پروآپوپتوزی است که منجر به پیشبرد مرگ سلولی می‌شود و پروتئین Bax سبب القای مرگ سلولی برنامه‌ریزی‌شده در سلول‌ها می‌شود [20]. در شرایط عادی Bax عمدتاً از طریق انتقال مجدد از میتوکندری به سیتوزول به وسیله BCL2L1 / Bcl-xL به طور سیتواسال در بدن وجود دارد و از انباشت سطح Bax سمی در غشای بیرونی بیضه میتوکندری جلوگیری می‌کند. تحت شرایط استرس، یک تغییر سازگاری رخ می‌دهد که باعث انتقال به غشای میتوکندریایی می‌شود که منجر به آزاد شدن سیتوکروم c می‌شود که پس از آن باعث آپوپتوز می‌شود. [21]. 
مطالعات اوگوشی و همکاران حاکی از آن است که چندین باکتری پروبیوتیک پاتوژنیک از جمله لاکتوباسیل‌ها ایمنی ذاتی را از طریق القای دفنسین القا می‌کنند. گزارش شده است سویه‌های بیماری‌زای Salmonella ssp و هلیکوباکتر پیلوری نیز باعث تحریک بیان hBD-2 می‌شوند [22]. اجزای باکتریایی لاکتوباسیل‌های پروبیوتیکی بیان دفسنسین را القا می‌کنند و بنابراین بر فعالیت ضد‌باکتریایی روده تأثیر می‌گذارند. درنتیجه، القای دفنسین‌ها توسط پروبیوتیک‌ها از جمله لاکتوباسیل‌ها ممکن است یک استراتژی درمانی جدید برای تقویت مکانیسم‌های دفاعی ذاتی باشد [23]. هدف از این پژوهش، تأثیر باکتری لاکتوباسیل کازئی بر بیان ژن بتا دفنسین و bax در سلول‌های سرطانی HT29 و تعیین امکان ترشح بتادفنسین از سلول‌های HT29 است.
مواد و روش‌ها 
مطالعه حاضر در مرکز تحقیقات ریزفناوری دارویی علوم‌پزشکی تبریز، در سال 1396 انجام شده است رده سلولی HT29 از بانک سلولی پاستور و باکتری از مرکز کلکسیون قارچ‌ها و باکتری‌های صنعتی ایران تهیه شد. به منظور شناسایی دقیق گونه لاکتوباسیل مورد‌استفاده، ابتدا گونه مورد‌نظر با استفاده از روش مولکولی مورد شناسایی قرار گرفت. محیط کشت MRS براث حاوی باکتری‌ها را به تیوب‌ها منتقل وبا 10000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 800 ماکرولیتر لیز بافر به تیوب‌ها افزوده شد. سپس تیوب‌ها به مدت 30 دقیقه در بن ماری 85 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. در مرحله بعد تیوب‌ها را به مدت 10 دقیقه در فریزر منهای 70 درجه قرار داده و دوباره در بن ماری 85 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد و بعد 700 ماکرولیتر محلول کلروفرم ایزوآمیل الکل به هر‌کدام از تیوب‌ها افزوده شد. سپس تیوب‌ها سانتریفیوژ شد و مایع رویی تیوب‌ها که حاوی DNA بود به تیوب‌های جدید انتقال داده شد. دوبرابر حجم نمونه‌ها ایزوپروپانل سرد به تیوب‌های جدید اضافه شد و تیوب‌ها به مدت یک شبانه‌روز در فریزر منهای 70 درجه قرار داده شد. سپس نمونه‌ها با 12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی بیرون ریخته شد. سپس 50 ماکرولیتر آب‌مقطر دیونیزه DNase free به هر کدام از تیوب‌ها افزوده شدند. بعد از اینکه DNA‌‌ها استخراج شد، ابتدا ارزیابی پرایمر‌ها و سفارش آن‌ها برای سنتز انجام شد. 
به منظور بررسی اثر کشندگی عصاره سلولی باکتری لاکتوباسیل کازئی روی رده سلولی HT29 از روش رنگ سنجی (MTTSigma Aldrich, Germany) استفاده شد. غلظت‌های 0/025، 0/05، 0/1، 0/25، 0/5، 1 میکروگرم در میکرولیتر از عصاره سلولی باکتری کشته‌شده در فاصله زمانی 24 ساعت روی رده سلولی HT29 تیمار شدند. بعد از گذشت زمان فوق محتوای چاهک‌های پلیت 96خانه‌ای به‌دقت خارج شد و به آن رنگ MTT‌ اضافه شد و به مدت چهار ساعت تحت شرایط CO25 درصد و دمای 37 درجه سانتی‌گراد نگه داشته شد. سپس رنگ MTT جداسازی شد و کریستال‌های فورمازان تولید و به وسیله سلول‌های زنده در ایزوپروپانول حل شدند.
رنگ آمیزی سلولی دپی (Dapi staining)
برای بررسی مستقیم اثرات عصاره کشته‌شده باکتری‌های لاکتوباسیلوس کازئی و خود باکتری زنده بر سلول‌های HT29، بعد از کشت سلول‌ها و تکثیر سلول‌ها در پلیت شش‌خانه‌ای، غلظت‌های مختلف باکتری‌های کشته‌شده و نیز خود باکتری زنده به اندازه بیست برابر سلول‌ها داخل هر چاهک پلیت شش‌خانه‌ای همراه چاهک‌های مش‌دار ریخته شد. محتویات سپس 24 ساعت با باکتری تیمار شدند و با افزودن 60 ماکرولیتر پارافرمال دهید 2 4 درصد به هر چاهک، باکتری را فیکس کرده سپس مایع رویی سلو ل‌ها را خالی کردیم. سلول‌های داخل هر چاهک با PBS، سه‌بار شست‌وشو شدند و سلول‌های داخل هر چاهک با محلول نفوذپذیر‌کننده Triton x-100 0/1 درصد به مدت 10 دقیقه نفوذپذیر شدند.
استخراج RNA
در ابتدا کل RNAهای تیمار‌شده و نشده با استفاده از کیت استخراج RNA (Fermantaz, Germany) طبق دستور العمل آن استخراج شد و غلظت آن به وسیله دستگاه اسپکتروفتومترنانودراپ (0) اندازه‌گیری شد.
سنتز cDNA
ساخت مولکول‌های DNA مکمل با کیت (Fermantaz, Germany) انجام گرفت. پرایمر‌های مورد‌استفاده توسط نرم‌افزار oligo 5 طراحی و توسط وب‌سایت NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov) )BLAST شدند و اطلاعات آن‌ها در جدول شماره 1 موجود است. 



پرایمرها توسط شرکت تکاپوزیست سنتز شدند.
انجام Real-time quantitative-PCR 
واکنش Real time PCR (BIO-RAD iQ5, USA) به صورت تکرارهای سه‌تایی و طبق برنامه دمایی که اطلاعات آن در جدول شماره 2 موجود است، صورت گرفت. 



بدین شکل که در تیوب‌های مخصوص Real time PCR 1 ماکرولیتر cDNA و 19 ماکرولیتر مسترمیکس سایبرگرین حاوی 1 ماکرولیتر پرایمر فوروارد (0/2 ماکرو مولار)، 1 ماکرولیتر پرایمر ریورز (0/2 ماکرو مولار)، 7 ماکرولیتر DEPC و 10 ماکرولیتر Mastermix 1x Real time ریخته شد. بعد تیوب‌ها در دستگاه Real time PCR قرار گرفت و دستگاه run شد. 
آنالیز اطلاعات بیان ژنی 
سیکل آستانه (CT) برای هرکدام از نمونه‌ها تعیین شد. میزان بیان در هر نمونه برای ژن‌های مربوطه و ژن GAPDH محاسبه شد. این محاسبه در نمونه‌های تیمار‌شده نسبت به نمونه کنترل که به وسیله میزان بیان ژن GAPDH نرمالایز شده، با استفاده از فرمول ارائه‌شده توسط pfaffl انجام شد. فرمول‌ محاسبات به شرح ذیل است (فرمول شماره 1). 


یافته‌ها
استخراج DNA باکتری لاکتوباسیلوس کازئی طبق پروتکل ذکرشده در قسمت مواد و روش‌ها انجام شد. همان‌طور که در تصویر شماره 1 نشان داده شده است، باند شارپ DNA در الکُتروفورز اگارز مشاهده می‌شود. با استفاده از دستگاه نانو دراپ، کمیت و کیفیت DNA ارزیابی شد. DNA بیشترین جذب در طول موج 260 نانومتر دارد و بیشترین طول موج جذب RNA و پروتئین به ترتیب 230 و 280 نانومتر است و همان‌طور که در شکل حاصل از نتایج دستگاه نانودراپ (تصویر شماره 1)، نشان داده شده است، همه نمونه‌های DNA استخراجی از کمیت و کیفیت بالا برخوردار بوده و بالاترین پیک جذب در طول موج 260 نانومتر است. 

در این پژوهش، به دو روش، سلول‌های سرطانی تیمار شدند. در روش اول تیمار سلول‌ها به مدت چهار ساعت به صورت کشت همجوار در داخل پلیت‌های حاوی ترانسفر ول با منافذ 0/1 میکرومتری و سپس حذف ترانسفر ول حاوی باکتری انجام شد و روش دوم کشتن باکتری‌ها با گرم و سرد کردن پشت سر هم و تیمار سلول‌ها انجام شد. در هر دو تیمار مدت 12 ساعت و 24 ساعت در نظر گرفته شد. پس از تیمار سلول‌ها با باکتری لاکتوباسیلوس کازئی، مشاهده شد سلول‌ها به سمت اپوپتوز حرکت می‌کنند. احتمال بیان ژن بتادفنسین در سلول‌ها به صفر می‌رسید، سلول‌های سرطانی کولون در کشت همجوار و با رن گآمیزی هسته که نشان‌دهنده آپوپتوز این سلول‌ها است.
همچنین طبق روش ذکر‌شده در فصل مواد و روش‌ها پس از تیمار سلول‌ها به منظور بررسی آپوپتوز سلول‌ها رنگ‌آمیزی dapi انجام شد. تصویر شماره 2 سلول‌های رنگ‌شده و غیر‌رنگ‌شده توسط میکروسکوپ نوری و فلورسنت تصویربرداری‌شده را نشان داده است. 
 

ارزیابی کیفی RNA استخراج‌شده
به منظور ارزیابی تغییرات بیان ژن‌ها، بعد ار تیمار HT29 با باکتری‌های لاکتوباسیلوس کازئی و عصاره سلولی آن، اقدام به استخراج RNA از سلول‌های HT29 تحت تیمار با باکتری وعصاره سلولی آن شد و سپس غلظت RNA نمونه‌ها با دستگاه نانودراپ اندازه گیری شد. جهت سنجش کیفیت RNA‌های استخراج‌شده، نمونه‌ها روی ژل الکتروفورز شدند (تصویر شماره 3). 
 

نتایج واکنش زنجیره‌­ای Real Time PCR
برای انجام این آزمایش سلول‌ها در پلیت‌های شش‌خانه‌ای با غلظت‌های IC50 کشت داده شدند و با باکتری‌های لاکتوباسیلوس کازئی و عصاره سلولی آن تیمار شدند که نتایج در تصویر شماره 4 دیده می‌شود. 

میزان بیان ژن های Bax و beta defencin در کشت همجوار سلول‌های سرطانی کولون HT29 با باکتری لاکتوباسیلوس کازئی در تصویرهای شماره 5 و 6 نشان داده شده است که به مدت 12 و 24 ساعت تیمار شدند و میزان تغییرات بیان ژن به روش Real time PCR مورد سنجش قرار گرفت (P=‌0/37).  

بحث
نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد با افزایش بیان ژن بتادفنسین در مواجهه با عصاره کشته‌شده لاکتوباسیل کازئی و باکتری زنده، باکتری توانایی تحریک تولید بتادفنسین انسانی را از سلول‌های کولون دارا بوده و خود باکتری به صورت زنده باعث القای اپوپتوز سلول‌های سرطانی می‌‌شود و همچنین بیان ژن Bax در بازه زمانی 12 ساعت اول تغییر معنی‌داری نشان نداد. مکانیسم اثر پروبیوتیک‌ها کاملاً شناخته‌شده نیست، ولی مکانیسم هایی برای توجیه اثرات پیشگیری‌کننده و درمانی آن‌ها در بیماری‌های انسان پیشنهاد شده است که از آن جمله می‌توان به تولید ترکیبات مهارکننده باکتری‌ها، تقویت سیستم ایمنی و نیز تحریک تولید پپتیدهای ضد‌میکروبی دفنسین از خود سلول‌های انسانی اشاره کرد [13]؛ بنابراین احتمال پروبیوتیک درمانی سرطان می‌تواند با دو مکانیسم، رشد سرطان را مهار نماید. اول با مهار مستقیم رشد باکتری‌های پاتوژن‌ها توسط خود پروبیوتیک‌ها و دوم مهار غیرمستقیم با تحریک ترشح بتادفنسین و پپتیدهای ضد‌میکروبی توسط سلول‌های انسانی. پپیتدهای ضدمیکروبی دارای 10 تا 150 اسید‌آمینه هستند که عملکرد ضد‌میکروبی آن‌ها بستگی به عوامل مختلفی مانند pH، فراوانی پپتید و غلظت نمک دارد [19]. پروتئین‌های ضد‌میکروبی به صورت نرمال از بخش‌های مختلف بدن مانند پوست، موکوس روده، موکوس دهان، مسیر تنفسی، چشم و سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان نیز تولید می‌شوند، اما بیان این پروتئین‌ها در شرایط عفونی مانند زخم‌ها یا التهاب‌ها به صورت القایی افزایش می‌یابد. این پپتیدها عمدتاً غشاهای میکروبی را مورد هدف قرار می‌دهند، در نتیجه به واسطه قابلیت کاربرد، آن‌ها، آنتی‌بیوتیک‌های نسل جدید به شمار می‌روند [24]. 
یک دسته از این پپتیدها دفنسین‌ها هستند که به سه گروه آلفا، بتا و تتا تقسیم می‌شوند. بتادفنسین‌ها یکی از بزرگ‌ترین اعضای این خانواده هستند و رونوشت آن‌ها در بسیاری از مهره‌داران، بی‌مهرگان و گیاهان یافت می‌شود. بیشتر دفنسین‌ها شش ریشه سیستئین دارند که برای فعالیت ضد‌میکروبی ضروری نیست، اما مقاومت بالایی نسبت به پروتئولیز باکتریایی را ایجاد می‌کنند. دفنسین‌ها در سلو ل‌ها و بافت‌هایی فراوان وجود دارندکه در دفاع میزبان ضدعفونت‌های میکروبی درگیر هستند [25]. ژن Bax یک نقطه ورود منحصربه‌فرد برای مسیر سیگنالینگ آپوپتوز درونی است. این مسیر توسط محرک‌های مختلف از جمله محرومیت سیتوکین و استرس سیتوتوکسیک آغاز می‌شود و درنهایت سبب القای مرگ سلولی برنامه‌ریزی‌شده در سلول‌ها می‌شود [26]. 
سلطان دلال و همکاران، اثر باکتری‌های پروبیوتیک روی بیان ژن‌های TLR2 و TLR4 و در سلول‌های HT29 عفونی‌شده با سالمونلا انتریتیدیس را مورد مطالعه قرار دادند. یافته‌ها نشان داد پس از تیمار سلول‌های سالم و غیرعفونی HT29، با هریک از دو باکتری پروبیوتیک، بیان ژن‌های TLR2-4 به طور چشمگیری افزایش داشت. برخلاف آن، میزان بیان این دو ژن در سلول‌های آلوده به سالمونلا انتریتیدیس، پیش و پس از درمان با هریک از باکتری‌های پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی به صورت معناداری کاهش یافت [27]. کریمی اردستانی و همکاران به شناسایی مولکولی باکتری پروبیوتیک کشته‌شده با حرارت و بررسی آپوپتوزیس القا‌شده توسط باکتری بر رده سلول HT-29 سرطان کولون پرداختند. لاکتوباسیلوس برویس در الگوی وابسته به زمان و دُز، بقا و تکثیر سلول‌های سرطانی کولون رده HT-29 را کاهش داد که بیشترین اثر سایتوتوکسیتی مربوط به رقت 1000 میکروگرم بر میلی‌لیتر در زمان 72 ساعت بود. درصد زیستایی در دُز و زمان در سلول‌های HT29 و HEK293 به ترتیب 23 و 50 درصد برآورد شد. آزمون قطعه‌قطعه شدن DNA هم، القای آپوپتوزیس توسط باکتری کشته‌شده با حرارت را تأیید کرد [28]. 
ستاری و احمدی‌زاده، به بررسی میزان بیان ژن‌های PTEN و AKT1 در کشت همجوار سلول‌های سرطانی کولون HT29 با باکتری استرپتوکوکوس ترموفیلوس پرداختند. نتایج نشان داد باکتری استرپتوکوکوس ترموفیلوس میزان بیان ژن AKT1 را کاهش و بیان PTEN را افزایش داده و سلول‌های سرطانی را به سمت آپوپتوز می‌برد. آزمایش MTT نشان داد که غلظت 0/05=OD بیشترین کشندگی طی چهار ساعت را دارد [29]. طبق مطالعه انجـام‌شـده توسط تـاونیتی و همکاران، سـویه‌های باکترایی پروبیوتیک لاکتوباســـــیلوس بولگـــــاریکوس و لاکتوباســیلوس کازئی ســبب کاهش درصــد بقــای سلول سرطانی HT29 و Caco-2 می‌شوند. نتایج این محققان نشان داد که اجزای سلولی باکتری کشـته‌شده با حرارت مانند دیواره سـلولی و پپتیدوگلیکان هم دارای اثرات سیتوتوکسـیک در برابـر سلول‌های سـرطانی هسـتند که با مطالعه ما هم‌خوانی دارد [30].
یان و همکاران نیز با تحقیق‌های خـود نشـان دادنــد که ترکیب‌های محلــول ترشــح‌شــده از لاکتوباسیلوس کازئی و لاکتوباسـیلوس رامنوسـوس باعث القای آپوپتوز در سلول‌های لوکمیای مونوسیتی می‌شوند؛ درنتیجه می‌توان پروبیوتیک را به عنـوان عاملی ایمن برای مبارزه با سرطان در نظر گرفت که هیچ‌گونه عارضه جانبی در پی ندارد و این با مطالعه ما هم‌خوانی دارد [31]. 
نتـایج حاصل از تحقیق‌های یبالدوین و همکاران نشـان داد که لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسـیلوس کازئی می‌توانـنـد باعــث افــزایش القــای آپوپتــوزیس در رده سلولی کارسینومای LS315 شوند و به عنوان ادجوانت با شیمی‌درمانی بـه کار گرفتـه شـوند که نتایج مطالعه مطابق با نتایج حاصل است [32]. در مطالعه علی‌اصغری و همکاران اثـرات عصـاره سلولی باکتری لاکتوباسیلوس کازئی در افزایش بیان ژن پروآپوپتوتیک Bax و کاهش بیان ژن Bcl2 در سلول سرطانی کولون و القای مـرگ برنامـه‌ریزی‌شده سـلولی نشـان داده شـد که با مطالعه ما هم‌خوانی دارد [33]. نتایج مطالعه عبدالان و همکاران در سال 2017 نشان می‌دهد که عصاره آبی برگ گیاه مازو بومی، دارای اثر توکسیسیتی علیه رده سلولی HT29 بوده و می‌تواند سبب القای آپوپتوز از طریق افزایش بیان ژن آپوپتوتیک Bax در سلول‌های HT29 شود که با مطالعه ما هم‌خوانی دارد [34].
نتیجه‌گیری
با وجود تحریک تولید بتادفنسین انسانی توسط عصاره کشته‌شده باکتری لاکتوباسیل، می‌توان از عصاره این باکتری‌ها در جهت تحریک سلول‌های سرطان برای تولید بتادفنسین، مهار پاتوژن‌ها، عدم تحریک سیگنالینگ‌های سلولی تکثیر و مبارزه با باکتری‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک استفاده کرد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه طبق نامه تأییدیه به شماره 5984 به تاریخ 1398/09/18 مورد تأیید کمیته اخلاق دانشگاهی قرار گرفته است.
حامی مالی
 این مطالعه در قالب پایان‌نامه دوره کارشناسی ارشد خانم مینا یاوری، مصوب دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اهر است.
مشارکت نویسندگان
هر دو نویسنده در طراحی، اجرا و نگارش همه بخش‌های پژوهش حاضر مشارکت داشته‌اند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.


 

References
1.Ljungh A, Wadström T. Lactic acid bacteria as probiotics. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2006; 7(2):73-89. [PMID]
2.Karamese M, Aydin H, Sengul E, Gelen V, Sevim C, Ustek D, et al. The immunostimulatory effect of lactic acid bacteria in a rat model. Iranian Journal of Immunology. 2016; 13(3):220-8. [PMID]
3.Korterink JJ, Ockeloen L, Benninga MA, Tabbers MM, Hilbink M, Deckers- Kocken JM. Probiotics for childhood functional gastrointestinal disorders: A systematic review and meta-analysis. Acta Paediatrica. 2014; 103(4):365-72. [DOI:10.1111/apa.12513]
4.Bezirtzoglou E, Stavropoulou E. Immunology and probiotic impact of the newborn and young children intestinal microflora. Anaerobe Journal. 2011; 17(6):369-74. [DOI:10.1016/j.anaerobe.2011.03.010] [PMID]
5.Parolin C, Marangoni A, Laghi L, Foschi C, Ñahui Palomino RA, Calonghi N, et al. Isolation of vaginal lactobacilli and characterization of anti-candida activity. PLoS One. 2015; 10(6):e0131220. [DOI:10.1371/journal.pone.0131220] [PMID] [PMCID]
6.Sakai F, Hosoya T, Ono-Ohmachi A, Ukibe K, Ogawa A, Moriya T, et al. Lactobacillus gasseri SBT2055 induces TGF-β expression in dendritic cells and activates TLR2 signal to produce IgA in the small intestine. PLoS One. 2014; 9(8):e105370. [DOI:10.1371/journal.pone.0105370] [PMID] [PMCID]
7.Zavala L, Golowczyc MA, van Hoorde K, Medrano M, Huys G, Vandamme P, et al. Selected Lactobacillus strains isolated from sugary and milk kefir reduce Salmonella infection of epithelial cells in vitro. Beneficial Microbes. 2016; 7(4): 585-95. [DOI:10.3920/BM2015.0196] [PMID]
8.Golowczyc MA, Mobili P, Garrote GL, Abraham AG, De Antoni GL. Protective action of Lactobacillus kefir carrying S-layer protein against Salmonella enterica serovar Enteritidis. International Journal of Food Microbiology. 2007; 118(3):264-73. [DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.07.042] [PMID]
9.Guandalini S, Cernat E, Moscoso D. Prebiotics and probiotics in irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease in children. Beneficial Microbes. 2015; 6(2):209-17. [DOI:10.3920/BM2014.0067] [PMID]
10.Bernstein CN. Antibiotics, probiotics and prebiotics in IBD. Nestle Nutrition Institute Workshop Series. 2014; 79:83-100. [DOI:10.1159/000360713] [PMID]
11.Schröder JM, Harder J. Human beta-defensin-2. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 1999; 31(6):645-51. [DOI:10.1016/S1357-2725(99)00013-8]
12.Tomalka J, Azodi E, Narra HP, Patel K, O’Neill S, Cardwell C, et al. β-Defensin 1 plays a role in acute mucosal defense against Candida albicans. Journal of Immunology. 2015; 194(4):1788-95. [DOI:10.4049/jimmunol.1203239] [PMID] [PMCID]
13.Bhattacharyya S, Ghosh SK, Shokeen B, Eapan B, Lux R, Kiselar J, et al. FAD-I, a Fusobacterium nucleatum cell wall-associated diacylated lipoprotein that mediates human beta defensin 2 induction through Toll-like receptor-1/2 (TLR-1/2) and TLR-2/6. Infection and Immunity. 2016; 84(5):1446-56. [DOI:10.1128/IAI.01311-15] [PMID] [PMCID]
14.Nami Y, Abdullah N, Haghshenas B, Radiah D, Rosli R, Khosroushahi AY. Assessment of probiotic potential and anticancer activity of newly isolated vaginal bacterium Lactobacillus plantarum 5BL. Microbiology and Immunology. 2014; 58(9):492-502. [DOI:10.1111/1348-0421.12175] [PMID]
15.Hassan Z, Mustafa S, Rahim RA, Isa NM. Anti-breast cancer effects of live, heat-killed and cytoplasmic fractions of Enterococcus faecalis and Staphylococcus hominis isolated from human breast milk. Journal of Molecular Oncology. 2016; 52(3):337-48. [DOI:10.1007/s11626-015-9978-8] [PMID]
16.Tauriello DVF, Calon A, Lonardo E, Batlle E. Determinants of metastatic competency in colorectal cancer. Molecular Oncology. 2017; 11(1):97-119. [DOI:10.1002/1878-0261.12018] [PMID] [PMCID]
17.Haghshenas B, Abdullah N, Nami Y, Radiah D, Rosli R, Khosroushahi AY. Different effects of two newly-isolated probiotic Lactobacillus plantarum 15HN and Lactococcus lactis subsp. Lactis 44 Lac strains from traditional dairy products on cancer cell lines. Anaerobe. 2014; 30:51-9. [DOI:10.1016/j.anaerobe.2014.08.009] [PMID]
18.Konishi H, Fujiya M, Tanaka H, Ueno N, Moriichi K, Sasajima J, et al. Probiotic-derived ferrichrome inhibits colon cancer progression via JNK-mediated apoptosis. Nature Communications. 2016; 7:12365. [DOI:10.1038/ncomms12365] [PMID] [PMCID]
19.Rengaraj D, Truong AD, Lillehoj HS, Han JY, Hong YH. Expression and regulation of avian beta-defensin 8 protein in immune tissues and cell lines of chickens. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 2018; 31(9):1516-24. [DOI:10.5713/ajas.17.0836] [PMID] [PMCID]
20.Tan C, Dlugosz PJ, Peng J, Zhang Z, Lapolla SM, Plafker SM, et al. Autoactivation of the apoptosis protein Bax increases mitochondrial membrane permeability and is inhibited by Bcl-2. The Journal of Biological Chemistry. 2006; 281(21):14764-75. [DOI:10.1074/jbc.M602374200] [PMID] [PMCID]
21.Wolter KG, Hsu YT, Smith CL, Nechushtan A, Xi XG, Youle RJ. Movement of bax from the cytosol to mitochondria. The Journal of Cell Biology. 1997; 139(5):1281-92. [DOI:10.1083/jcb.139.5.1281] [PMID] [PMCID]
22.Ogushi K, Wada A, Niidome T, Mori N, Oishi K, Nagatake T, et al. Salmonella enteritidis FliC (flagella filament protein) induces hu beta-defensin-2 mRNA production by Caco-2 cells. The Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(32):30521-6. [DOI:10.1074/jbc.M011618200] [PMID]
23.Schlee J, Harder B, Köten B, Stange EF, Wehkamp J, Fellermann K. Probiotic lactobacilli and VSL#3 induce enterocyte β-defensin 2. Clinical & Experimental Immunology. 2008; 151(3):528-35. [DOI:10.1111/j.1365-2249.2007.03587.x] [PMID] [PMCID]
24.Meade KG, O’Farrelly C. β-defensins: Farming the microbiome for homeostasis and health. Frontiers in Immunology. 2018; 9:3072. [DOI:10.3389/fimmu.2018.03072] [PMID] [PMCID]
25.Bayer A, Lammel J, Rademacher F, Groß J, Siggelkow M, Lippross S, et al. Platelet-released growth factors induce the antimicrobial peptide human beta-defensin-2 in primary keratinocytes. Experimental Dermatology. 2016; 25(6):460-5. [DOI:10.1111/exd.12966] [PMID]
26.Trusheva B, Trunkova D, Bankova V. Different extraction methods of biologically active components from propolis: A preliminary study. Chemistry Central Journal. 2007; 1:13. [DOI:10.1186/1752-153X-1-13] [PMID] [PMCID]
27.Soltan Dallal MM, Moshiri M, Mirshafiey A, Douraghi M, Rezaie F, Gholami M. [Evaluation of the effect of probiotic bacteria Lactobacillus acidophilus PTCC1643 and Lactobacillus casei PTCC 1608 on the TLR2 and TLR4 expression in HT29 cells infected with Salmonella enteritidis (Persian)]. Tehran University of Medical Journal. 2019; 76(11): 724-30. http://tumj.tums.ac.ir/article-1-9383-fa.html
28.Karimi Ardestani S, Tafvizi F, Tajabadi Ebrahimi M. [Molecular detection of heat-killed probiotic bacteria and study of apoptosis induction on colon cancer HT-29 cell line (Persian)]. Iranian Journal of Microbiology. 2016; 10(2):42-52. http://ijmm.ir/article-1-521-fa.html
29.Sattari S, Ahmadizadeh C. [The study of expression of PTEN and AKT1 genes in co-culturing of HT29 colon cancer cell line with Streptococcus thermophilus (Persian)]. Journal of Kashan University of Medical Sciences. 2018; 22(6): 624-31. http://feyz.kaums.ac.ir/article-1-3648-en.html
30.Taverniti V, Guglielmetti S. The immunomodulatory properties of probiotic microorganisms beyond their viability (ghost probiotics: Proposal of paraprobiotic concept. Journal of Genetics and Nutrition. 2011; 6(3):261-74. [DOI:10.1007/s12263-011-0218-x] [PMID] [PMCID]
31.Yan F, Brent Polk D. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 2002; 277(52): 50959-65. [DOI:10.1074/jbc.M207050200] [PMID] [PMCID]
32.Baldwin C, Millette M, Oth D, Ruiz MT, Luquet FM, Lacroix M. Probiotic Lactobacillus acidophilus and L. casei mix sensitize colorectal tumoral cells to 5-fluorouracil-induced apoptosis. Journal of Nutrition and Cancer. 2010; 62(3):371-8. [DOI:10.1080/01635580903407197] [PMID]
33.Ali Asgari E, Mirzaie A, Noorbazargan H, Bagheri Kashtali A. [Cytotoxicity effect of lactobacillus casei cell extract as indigenous probiotic bacterium on colon cancer cell line (HT29) and analysis of bax and Bcl2 apoptosis gene expression (Persian)]. Armaghan-e-Danesh. 2017; 21(12):1192-206. http://armaghanj.yums.ac.ir/article-1-1673-fa.html
34.Abdalan S, Baghbani-Arani F, Sadat Shandiz SA. [Evaluation of anticancer effect of aqueous and hydroalcoholic extracts of quercusin fectoria leaf against colon cancer HT29 cell line (Persian)]. Journal of Arak University of Medical Sciences. 2018; 21(4):48-57. http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-5491-fa.html