مقدمه
امروزه استفاده از آنتی‌بادی‌های منوکلونال (mAb) برای تشخیص و درمان بیماری‌های گوناگون از جمله سرطان تبدیل به یک روش استاندارد و مؤثر شده است. اکنون بیش از 70 آنتی‌بادی منوکلونال در بازار دارویی دنیا موجود است و تعداد زیادی نیز در مراحل کارآزمایی قرار دارند [1]. با این وجود در برخی از موارد آنتی‌بادی‌های منوکلونال دارای محدودیت‌هایی نیز هستند، برای مثال بزرگی و پیچیدگی مولکول از پتانسیل نفوذ آن به بافت‌های توموری می‌کاهد و یا ساختار مسطح بخش‌های تعامل‌کننده نفوذ به عمق حفره‌های کاتالیتیک در آنزیم‌ها را با دشواری مواجه می‌کند [2 ,3]. برای برطرف کردن چنین محدودیت‌هایی و افزایش فعالیت ضدتوموری آنتی‌بادی‌ها رویکردهای متفاوتی مثل مهندسی آنتی‌بادی برای افزایش افینتی، ابداع آنتی‌بادی‌های کونژوکه، استفاده از قطعات آنتی‌بادی‌ها و نهایتاً ایجاد آنتی‌بادی‌های دوخصیصه‌ای وجود دارد. اتصال به دو هدف متفاوت با یک مولکول آنتی‌بادی واحد یک ایده جذاب در تحقیقات درمان سرطان است. چنین مولکول‌هایی قادر به انجام چند عمل هستند: 1) مهار رسپتور سطح سلولی؛ 2) بلوک کردن هم‌زمان دو لیگاند؛ 3) اتصال متقاطع دو رسپتور سطحی؛ 4) در مجاورت تومور قرار دادن سلول T [4]. تاکنون سه آنتی‌بادی دوخصیصه‌ای توانسته‌اند از مراجع قانونی مجوز ورود به بازار را کسب کنند: Catumaxomab [5]، blinatumomab و Emicizumab [6]. از مزایای ترکیبات دوخصیصه‌ای می‌توان به اثر دوجانبه آن‌ها روی اهداف متفاوت توموری و ایجاد تأثیرات دارویی تجمعی یا سینرژیک به دلیل هم‌پوشانی مسیرهای سیگنالینگ سرطان اشاره کرد. این آنتی‌بادی‌ها دارای فرمت‌های بسیار متنوعی هستند که شامل انواع دارای بخش Fc و انواع فاقد آن است [4]. فرمتBiTE (Bispecific T cell engager) شامل دو تک‌زنجیره آنتی‌بادی است که از طریق یک لینکر پلی پپتیدی به هم متصل شده‌اند. در BiTEها یک بازو علیه CD3 و یک بازو علیه آنتیژن توموری هدف‌گیری شده. از ویژگی‌های این فرمت می‌توان به توانایی فعال‌سازی وابسته به آنتیژن پلیکلونال سلول T و القا پرولیفریشن سلول T اشاره کرد. بدین‌ترتیب BiTE توانایی زیادی در لیز کردن سلول هدف دارد. بلیناتومومب یا در واقع CD3×CD19bsAb anti اولین داروی از خانواده BiTE است که شرکت Amgen برای درمان ALL (Acute Lymphoblastic leukemia) و NHL (non-Hodgkin’s lymphoma) در سال 2014 معرفی کرده [7].
بلیناتومومب فیوژن پروتئینی با وزن مولکولی KD 55 و شامل دو زنجیره متغیر آنتی‌بادی scFv (Single Chain Fragment Variable) است. این پروتئین از طریق cDNA چهار دامین متغیر به علاوه سه پپتید لینکر ساخته شده، دو لینکر بلند برای اتصال برای ساخت بخش scFv و یک لینکرکوتاه برای متصل کردن این دو بخش. این ساختار انعطاف و آزادی عمل لازم اتصال هریک از بازوها به اپیتوپهای هدف واقع بر سطح دو سلول را فراهم می‌کند. در بخش N ترمینال این پروتئین scFv متصل‌شونده به CD19 مشتق از آنتی‌بادی موشی mAb HD37 و در بخش C ترمینالscFv متصل‌شونده به 3CD مشتق از آنتی‌بادی موشی mAb L2K قرار دارد [8]. وجود یک توالی هگزاهیستیدینی در C ترمینال این پروتئین امکان تخلیص آن توسط رزین‌های افینیتی کروماتوگرافی IMAC Immobilized metal ion affinit (chromatography) را فراهم می‌کند [9].
بیان دائمی و بالای مولکول CD19 روی سلول‌های بدخیم B و نقش آن در بقا و پرولیفراسیون این سلول‌ها باعث شد که به عنوان شاخص هدف روی سلولB در نظر گرفته شود، برخلاف CD20 و CD22 رسپتور CD19 تقریباً در تمامی مراحل رشدی دودمان سلول B بیان می‌شود، از این رو یک مارکر مطمئن برای درمان این رده محسوب می‌شود. از طرف دیگر نشان داده شده که در افراد بیمار تقریباً 100 درصد سلول‌های دچار بدخیمی این آنتیژن را بیان می‌کنند [10]. CD19 یک فعال‌کننده PI3 کیناز است، این آنزیم یک عنصر کلیدی در میسر سیگنالینگ در سلول‌های بدخیم است [11]. عملکرد in vitro مربوط به CD3×CD19 anti در آزمایش‌های کشت هم‌زمان سلول T و سلول‌های بیان‌کننده CD19 بسیار چشمگیر بوده؛ حداقل غلظت مورد نیاز برای لیز سلول هدف واجد CD19 در حدود pg/ml است [12].
T سل‌های CD3+ ،CD4+ یا CD8+ توانایی مشابهی در لیز سلول‌های هدف نشان می‌دهند و با قدرت این کار را می‌کنند. البته سلول‌های T naïve در این مورد استثنا هستند [13]. خود CD3×CD19 anti برای فعال‌سازی سلول T کفایت لازم را داراست و نیازی به فعال‌سازی قبلی یا مواد کمک محرکی نیست، فعال شدن سلول T منجر به بیان و ظهور CD69 و C25 و همچنین Up regulation ژن مولکول‌های چسبانی مثل CD2 بر سطح آن شده و از طرف دیگر باعث رهایش سیتوکاین‌های التهابی مثل IFNϒ ,TNFα ,IL2 ,IL6 ,IL1 و نهایتاً تکثیر متوالی سلول‌های T می‌شود [14]. مکانیسم سلول‌کشی سلول T در مورد سلول هدف دارای CD19 شامل تشکیل یک سیناپس سیتولیتیک محکم بین دو سلول و متعاقب آن تخلیه پروتئین‌های سمی پرفورین و گرآنزیم‌ها از وزیکول‌های ترشحی T سل روی سلول هدف است. فعال شدن آنزیم‌های کاسپاز در سلول هدف گویای اهمیت مسیر آپپتوز به موازات مسیر وزیکول‌های ترشحی برای از بین بردن سلول هدف است [8].
امروزه برای تولید پروتئین‌های نوترکیب درمانی از جمله آنتی‌بادی‌های منوکلونال از میزبان‌های گوناگونی شامل: باکتری، باکولوویروس، مخمر، سلول‌های گیاهی و سلول‌های پستانداری استفاده می‌شود [15] که از بین آن‌ها رده سلول‌های پستانداری به علت داشتن توانایی تولید پروتئین با تاخوردگی طبیعی و ایجاد تغییرات پس از ترجمه (Post Translational Modifications) صحیح اهمیت ویژه دارند. رده سلولی CHO (Chinese hamster ovary) پرکاربردترین رده سلولی برای تولید آنتی‌بادی‌هاست، به نحوی که حدود دو سوم از پروتئین‌های نوترکیب درمانی در این رده تولید می‌شوند [16]. رده سلولی HEK293 human embryonic kidney) (سلول جنینی کلیه انسان است و در حال حاضر به طور گسترده‌ای برای بیان موقت (Transient Gene Expression) TGE پروتئین‌های نوترکیب استفاده می‌شود و علی‌رغم منشأ اپیتلیالی به‌خوبی با شرایط کشت معلق سازگاری می‌یابند. به دلیل انسانی بودن این رده پروتئین‌های نوترکیب بیان‌شده در آن، از نظر تغییرات پس از ترجمه مشابه پروتئین‌های انسانی هستند و روند ترجمه، تاخوردگی و بلوغ آن‌ها با کفایت چشمگیری صورت می‌گیرد. رویکرد بیان موقت ژن معمولاً برای تولید مقادیر زیاد پروتئین در زمان کوتاه برای بررسی‌های بیوشیمیایی و بیوفیزیکی دارو و انجام مطالعات پیش‌بالینی استفاده می‌شود [17, 18]. سلول Expi 293 یک رده مشتق از سلول HEK293 است که برای کشت در شرایط معلق با تراکم سلولی بالا و در محیط کشت عاری از سرم و به شکل Chemically Defined تطابق یافته ویژگی‌ها این سلول را برای تولید صنعتی مناسب کرده [19].
هرچند در حال حاضر سیستم بیانی سلول‌های پستانداری سیستم روش رایج تولید این آنتی‌بادی است اما در مقابل پتانسیل باکتری Escherichia coli برای تولید پروتئین‌های بدون الگوی گلایکوزیلاسیون و همچنین سهولت دست‌ورزی فرآیند تولید و ارزان بودن مواد اولیه کشت باکتریال این میزبان را به میزبان مناسب برای تولید آنتی‌بادی‌های فاقد Fc و آنتی‌بادی‌های دوخصیصه‌ای تبدیل کرده است [20]، به طوری که اکنون تولید بخش قابل توجه‌ای از پروتئین‌های درمانی فاقد الگوی گلایکوزیلاسیون در این میزبان انجام می‌شود و در این میان سویه BL21 (DE3) یکی از رایج‌ترین سویه‌های صنعتی و تحقیقاتی است. تاریخچه طولانی استفاده صنعتی از ای.کولای و همچنین قوانین مناسب بخش‌های نظارتی تولیدی دارو در رابطه با این میزبان از مزیت‌های توجه‌برانگیز این پلت‌فرم تولید است [21].
در این پژوهش سعی شده است با توجه به تک‌زنجیره و بدون گلایکوزیلاسیون بودن بلیناتومومب از ظرفیت سیستم بیانی باکتری برای تولید این آنتی‌بادی و مقایسه آن با آنتی‌بادی تولیدشده در سلول یوکاریوتی استفاده شود، چون درباره آنتی‌بادی بلیناتومومب تاکنون چنین مقایسه‌ای صورت نگرفته. مزایای زیاد ای.کولای به عنوان میزبان مناسب از نظر پارامترهای تولید صنعتی و در دسترس بودن محیط‌های کشت ارزان‌قیمت برای تولید زیست‌داروها در این میزبان و همچنین قابل بیان بودن آنتی‌بادی‌های منوکلونال دوخصیصه‌ای خانواده BiTE (به دلیل نداشتن تغییرات پس از ترجمه‌ای) در آن از یک سو و وجود این واقعیت که تولیدکننده تجاری بلیناتومومب را در میزبان CHO بیان نموده، از سوی دیگر ما را برآن داشت که در این پژوهش به بررسی بیان و ویژگی‌های اتصالی آنتی‌بادی بیان‌شده در هر دو سیستم و مقایسه آن‌ها بپردازیم.
مواد و روش‌ها
سلول‌ها و موادمصرفی
سلول Expi293F و محیط کشت مربوطه (Expi293™Expression Medium) و ماده ترانسفکشن مخصوص به آن (ExpiFectamine™293 transfection Reagent) و همچنین آنتی‌بیوتیک Pen/Strep و L-Glu و وکتور pcDNA3.1 (+) از شرکت Invitrogen (CA, USA) تهیه شدند. رزین کروماتوگرافی Ni-NTA از شرکت QIAGEN (USA)خریداری شد. تریپان بلو و ماده 3و ´3دی آمینوبنزیدین (DAB) و آنتی پلی هیستیدین کونژوگه با HRP و TMB از شرکت (USA) Sigma-Aldrich تهیه شدند. سویه E.Coli BL21 (DE3) و وکتور pET-22b از شرکت (USA) Novagen تهیه شدند. آنزیم‌های محدودکننده از شرکت (USA) Thermo Fisher Scientific خریداری شدند. رده سلولی NALM-6 و Jurkat از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران تهیه شدند.
سازه بیانی و بیان در E.Coli 
سازه بیانی بیان‌کننده آنتی‌بادی دوخصیصه‌ای بلیناتومومب از وکتور pGH در وکتور pET-22b توسط آنزیم‌های HindIII و NcoI کلون گردید. سویه BL21 (DE3) برای بیان پروتئین استفاده شد؛ وکتور pET-22b برای بیان پری پلاسمیک پروتئین هدف طراحی شده است و سویه ترانسفورم شده توسط وکتور بیانی در محیط کشت LB واجد آمپیسیلین تا رسیدن به 0/5=OD در طول موج 600 نانومتر انکوبه شد. سپس برای القا از IPTG باغلظت 0.5mM استفاده شد. جداسازی سلول‌ها با استفاده از سانتریفیوژ پس از 4 ساعت کشت صورت گرفت، یک بچ کشت بدون القا هم به‌منزله کنترل منفی در نظر گرفته شد.
سازه بیانی و بیان رده سلولی Expi293F
توالی کدکننده پروتئین بلیناتومومب از وکتورpGH در وکتور pcDNA3.1 برای ساخت سازه بیانی در سیستم سلولی، توسط دو آنزیم NheI و HindIII ساب کلون شد، سپس این سازه بیانی به سلول‌های Expi293F ترانسفکت شدند. سلول‌های Expi293F در محیط کشت اختصاصی و بدون سرم Expi293™ Expression Medium به همراه آنتی‌بیوتیک‌های پنیسیلین استرپتومایسین (2mM) کشت شدند. سلول‌ها در شیکر انکوباتور CO2 در محیط مرطوب و در بطری‌های شیشه‌ای در حال دوران با سرعت 125rpm کشت شدند. سلول‌ها هر سه روز یک بار در چگالی حدوداً 3×10 5 cells/mL پاساژ داده می‌شدند. از روش شمارش سلولی با تریپانبلو برای محاسبه تعداد سلول‌ها استفاده شد. به طور خلاصه ترانسفکشن طبق شیوه‌نامه شرکت سازنده و به این نحو صورت گرفت: روز پیش از ترانسفکشن سلول‌ها در محیط فاقد ماده افزودنی کشت شدند؛ روز بعد، ماده ترانسفکت‌کننده (ExpiFectamine™293 Reagent) و پلاسمید که با نسبتی مشخص با هم مخلوط شده بودند بعد انکوباسیون به سلول‌ها اضافه شدند. پس از 16 تا 18 ساعت هم ExpiFectamine™ Transfection Enhancer 1&2 براساس دستورالعمل سازنده به سلول‌ها افزوده شدند. در روز هفتم محیط رویی از سلول‌ها جدا شده و برای ارزیابی میزان بیان ذخیره گردید. 
تخلیص پروتئین
برای تخلیص آنتی‌بادی بیان‌شده توسط رده سلولی Expi293F از ستون Ni-NTA (Ni-Nitrilotriacetic acid) استفاده شد؛ ابتدا سوپ سلولی توسط فیلتر 0/45 میکرومتر فیلتر شد. سپس ستون با بافر Binding (NaH2PO4 (50mM), NaCl (300 mM), imidazole (10 mM), pH =8/0) شست‌وشو داده شد؛ در مرحله بعد نمونه با سرعت 1ml/min روی ستون اعمال گردید و سپس ستون توسط بافر Wash (NaH2PO4 (50mM), NaCl (300 mM), imidazole (20 mM), pH =8/0) شست‌وشو داده شد و نهایتاً بافر NaH2PO4 (50mM), NaCl (300 mM), imidazole (250 mM) pH =8/0)Elution پروتئین مورد نظر را از ستون خارج کرد. برای تخلیص پروتئین بیان‌شده در باکتری مراحل کار مشابه با تخلیص پروتئین بیان شده از سلول بود. با این تفاوت که ترکیب شیمیایی بافرهای سه‌گانه به این شرح تغییر یافته بود:
Binding buffer: (100mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea pH =8)
Washing buffer: (100mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea pH =6/3)
Elution buffer: (100mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea pH =4/5)
 آنالیز SDS PAGE و وسترن بلات
از آنالیز SDS PAGE و وسترن بلات برای ارزیابی میزان بیان پروتئین استفاده شد. رنگ‌آمیزی کوماسی بلو برای آشکارسازی پروتئین‌ها به کار رفت. پروتئین‌ها در ولتاژ 100 ولت در زمان 80 دقیقه در ژل 12 درصد الکتروفورز شدند. متعاقب SDS PAGE وسترن بلاتینگ صورت پذیرفت. این فرایند توسط دستگاه semi-dry transfer cell Trans-Blot(Biorad) با استفاده از غشای نیترو سلولز (GE Healthcare) برای انتقال پروتئین‌ها انجام شد؛ پس از انتقال، غشا توسط آلبومین سرم گاوی (BSA) 4 درصد بلوکه شد. در مرحله بعد از آنتی‌بادی علیه پلی‌هیستیدین کونژوگه با HRP در رقت 1:1500 استفاده گردید، برای ظاهر شدن لکه‌های پروتئینی از روش 3 و 3 دآمینوبنزیدین (DAB) استفاده شد.
سنجش الایزا
برای بررسی سطح بیان آنتی‌بادی ترشح‌شده توسط دو سیستم بیانی مختلف از یک تست الایزا استفاده شد. به این منظور رده سلول‌های بیان‌کننده CD19 به نام NALM-6 و رده سلولی بیان‌کننده CD3 به نام Jurkat در پلیت 96 خانه به مدت یک شب کشت شدند. سپس سلول‌ها با استفاده از فرمالدهید 3/7 درصد تثبیت شدند، پس از سه بار شست‌وشوی سلول‌ها، سطوح اشغال‌نشده چاهک توسط آلبومین سرم گاوی 2 درصد به مدت یک ساعت بلوکه شدند. در مرحله بعد سلول‌ها با رقت‌های سریالی از آنتی‌بادی بیان‌شده در C°4 به مدت یک شب انکوبه شدند (pg/ml 12/5، 6/25، 3/12، 1/56، 0/78). پس از مراحل شست‌وشوی مجدد μl100 از آنتی‌بادی علیه پلی هیستیدین کونژوگه با HRP در رقت 1:250 در BSA 1 درصد به هر چاهک افزوده شد. پس از یک ساعت و شست‌وشوی مجدد μl100 از ماده TMB (3,30,5,50 Tetramethylbenzidine) برای انجام واکنش رنگ‌زایی به هر چاهک افزوده شد. نهایتاً جذب نوری هر چاهک با دستگاه خوانش الایزا در طول موج nm 450 قرائت شد. از رده سلولی فاقد مارکرهای CD19 ,CD3 (سلولCHO) هم به عنوان کنترل منفی استفاده شد.
یافته‌ها
تولید سازه‌های بیانی
توالی کدکننده ژن بلیناتومومب با موفقیت در وکتور pcDNA3.1 با استفاده از دو آنزیم محدودکننده NheI و HindIII کلون شد. برای تأیید صحت کلونینگ سازه ساخته‌شده توسط دو آنزیم مذکور هضم آنزیمی شد که منجر به ایجاد دو قطعه با سایز حدوداً bp 1600 و 5400 گردید (تصویر شماره 1-الف).

درباره سازه بیانی در باکتری هم توالی کدکننده با موفقیت در وکتور pET-22b کلون شد، هضم آنزیمی در این مورد هم نشان‌دهنده ایجاد دو قطعه bp 5000 و 1600 شد (تصویر شماره 1-ب). در نهایت با تعیین توالی سازه‌های ایجادشده صحت کلونینگ در هر دو مورد تأیید شد. 
آنالیز بیان پروتئین
میزان بیان در هر دو سیستم بیانی متعاقب انجام تخلیص پروتئین با ستون نیکل صورت گرفت (تصویر شماره 2) و پروتیئن تخلیص‌شده از هر سیستم تعیین غلظت شد.

این میزان درباره سلول Expi293F به میزان mg/L 2/3 و درباره سیستم بیان در باکتری mg/L100 بود. آنالیز SDS PAGE و متعاقباً وسترن بلات برای هرکدام از سیستم‌های بیانی انجام شد که مبین بیان پروتئین 55 کیلو دالتونی هدف در جایگاه مربوطه بود (تصویر شماره 3).

برای بررسی درصد بیان در هرمورد، از سیستم دانسیتومتری برای تعیین میزان چگالی هر باند در ژل SDS PAGE استفاده شد. نتایج این آنالیز نشان داد که باند مربوط به سیستم بیانی در باکتری حدوداً 19/3 درصد از کل پروتئین‌ها و باند مربوط به سیستم بیان سلول پستانداری در حدود 7/1 درصد از کل پروتئین‌های کشت را شامل می‌شود (جدول شماره 1).


بررسی توانایی اتصال آنتی‌بادی به سلول هدف
بررسی توانایی اتصالی آنتی‌بادی بیان‌شده با استفاده از آزمون الایزا بررسی شد. دو رده سلولی NALM-6 برای CD19 و رده سلولی Jurkat برای CD3 استفاده شد. هر دو رده با رقت‌های سریالی از آنتی‌بادی تیمار شدند (تصویر شماره 4).

نتایج مبین این بود که میزان اتصال آنتی‌بادی بیان‌شده از سیستم سلولی Expi293F حدوداً دوبرابر بیشتر از اتصال آنتی‌بادی بیان‌شده در سویه BL21 (DE3) است.
بحث
هرچند که امروزه سیستم بیانی سلول‌های پستانداری در صنعت بایو فارما جایگاه ویژه‌ای به خود اختصاص داده‌اند اما ویژگی‌های خاص این سیستم مانند حساسیت زیاد، گران بودن محیط‌های کشت و پیچیدگی ذاتی سلول‌های یوکاریوتی و همچنین زمان‌بر بودن فرآیند کشت این سلول‌ها این فرصت را در زمینه تحقیقات تولید صنعتی پروتئین‌های درمانی برای محققین به وجود آورده تا در مواردی که امکان جایگزینی میزبان‌های ساده‌تر و ارزان‌تر وجود داشته باشد، از سیستم‌های جایگزین استفاده کنند. این امر درباره تولید قطعات آنتی‌بادی یا آنتی‌بادی‌های تک‌زنجیره‌ای که فاقد الگوی گلایکوزیلاسیون هستند هم مصداق دارد. یک چالش در این زمینه بررسی امکان تولید هر مولکول پروتئین کاندیدای دارویی یا آنتی‌بادی در سیستم‌های بیانی ساده‌تر مانند باکتری است، در واقع لازم است که درباره هر پروتئین امکان تولید را در سیستم‌های ارزان‌تر به طور مجزا بررسی کرد. از این رو بررسی امکان تولید آنتی‌بادی علیه مارکر CD19 به عنوان یک داروی توانمند و در عین حال گران‌قیمت در درمان سرطان خون پژوهش شد (این آنتی‌بادی در زمان عرضه گران‌قیمت‌ترین آنتی‌بادی درمانی عرضه شده بود). در این مطالعه سعی شد با استفاده از روش تولید سریع آنتی‌بادی درسیستم بیانی پستانداری (سیستم بیان موقّت) و بیان هم‌زمان در سیستم باکتریال به مقایسه و بررسی پروتئین تولیدشده پرداخته شود.
پس از کلونینگ و بیان موفق آنتی‌بادی دوخصیصه‌ای در هر دو سیستم این آنتی‌بادی تخلیص و تولید آن تأیید شد. میزان بیان در باکتری و سلول Expi293F به ترتیب به میزان mg/L 100و 2/3 بود. مک و همکاران با بیان آنتی‌بادی دو خصیصه‌ای anti-EpCAM × anti-CD3 در فرمت BiTE در میزبان باکتری به بیان mg/L15 دست پیدا کردند [22]. در مطالعه‌ای دیگر ام سی سل و همکاران توانستند یک آنتی‌بادی دوخصیصه‌ای در فرمتی مشابه را علیه anti-HER2/neu×anti-CD16 در باکتری با سطح بیان حدود mg/L 7/3 تولید کنند. کو و همکاران نیز توانستند در میزبان CHO-K1 آنتی‌بادی anti-CD123×anti-CD3 در فرمتی شبیه به BiTE به میزان حدود mg/L 5 بیان کنند [23]. با وجود اینکه سطح بیان در سیستم‌های بیانی E.Coli عموماً بالاتر از سیستم‌های بیانی پستانداری است اما روت و همکاران توانستند برای بیان آنتی‌بادی دوخصیصه‌ای anti-P-cadherin×anti-CD3 در سلول CHO با یک فرمت مشابه BiTE به سطح بیان چشمگیر mg/L 1300 دست پیدا کنند [24]. د ناردیس و همکارن توانستند آنتی‌بادی دوخصیصه‌ای علیه HER2 و HER3 را در میزبان CHO-DG44 در فرمت شبه IgG با سطح بیان حدود mg/L 1200 تولید کنند [25]. هرچند در این مطالعه سیستم باکتری توانایی تولید مقادیر بیشتری از آنتی‌بادی را نشان داد اما آنتی‌بادی تولیدشده در مقایسه با سلول‌های پستانداری قدرت اتصال پایین‌تری کمتری داشت. بررسی ویژگی‌های اتصالی آنتی‌بادی تولیدشده در هرکدام از سیستم‌ها به کمک آزمون الایزا، نشان داد که سیستم بیان پستانداری در تولید آنتی‌بادی از سیستم تولید باکتریال کارآمدتر است، یعنی میزان اتصال به هرکدام از شاخص‌های هدف (یعنی CD19 و CD3) به طور متوسط حدود دوبرابر است. این امر احتمالاً ناشی از تفاوت در سیستم‌های فولدینگ و پردازش پروتئینی در سلول پستانداری و باکتری‌هاست. مطالعات پیشین نیز نشان‌دهنده نتایج مشابهی هستند [22]. برای بررسی دقیق‌تر قدرت اتصال آنتی‌بادی تولیدشده می‌توان از آنالیز فلوسایتومتری و همچنین برای بررسی اثر سایتوتوکسیک آنتی‌بادی بر سلول هدف می‌توان از سیستم کشت مختلط لنفوسیتی در حضور سلول‌های هدف استفاده کرد [26 ،12]. همچنین برای بررسی‌های بیشتر می‌توان بیان این آنتی‌بادی را در سایر سیستم‌های بیانی رایج مانند سایر سلول‌های پستانداری و یا سلول‌های مخمری مطالعه کرد، یک رویکرد دیگر نیز استفاده از وکتورهای بیانی متفاوت در سیستم بیان پستانداری است.
نتیجه‌گیری
انجام این پژوهش نشان داد که درباره آنتی‌بادی‌های دوخصیصه‌ای خانواده BiTE مانند بلیناتومومب، سلول‌های پستانداری سیستم بیانی کاراتر و موفق‌تری هستند، هرچند باکتری توانایی تولید مقادیر بسیار بیشتری از آنتی‌بادی را دارد.

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این پژوهش دارای کد اخلاق IR.PII.REC.1399.008 از انستیتو پاستور ایران است.

حامی مالی
این پژوهش با استفاده از گرنت تحقیقاتی انستیتوپاستور ایران و در این مؤسسه انجام شده است. 

مشارکت نویسندگان
روش‌‌شناسی آزمایشگاهی و پژوهشی: رضا معظمی و فاطمه ندافی؛ تحلیل داده‌ها، نگارش و ویرایش متن: همه نویسندگان؛ ایده پژوهشی و مفهوم‌سازی: فاطمه دوامی.

تعارض منافع
نویسندگان هیچ‌گونه تعارض منافعی اعلام نکردند.
 

References
1.Wurm FM. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature Biotechnology. 2004; 22(11):1393-8. [DOI:10.1038/nbt1026] [PMID]
2.Weidle UH, Auer J, Brinkmann U, Georges G, Tiefenthaler G. The emerging role of new protein scaffold-based agents for treatment of cancer. Cancer Genomics-Proteomics. 2013; 10(4):155-68. [PMID]
3.Cruz E, Kayser V. Monoclonal antibody therapy of solid tumors: Clinical limitations and novel strategies to enhance treatment efficacy. Biologics: Targets & Therapy. 2019; 13:33-51. [DOI:10.2147/BTT.S166310] [PMID]
4.May C, Sapra P, Gerber HP. Advances in bispecific biotherapeutics for the treatment of cancer. Biochemical Pharmacology. 2012; 84(9):1105-12. [DOI:10.1016/j.bcp.2012.07.011] [PMID]
5.Thakur A, Lum LG. “NextGen” biologics: Bispecific antibodies and emerging clinical results. Expert Opinion on Biological Therapy. 2016; 16(5):675-88. [DOI:10.1517/14712598.2016.1150996] [PMID]
6.Husain B, Ellerman D. Expanding the boundaries of biotherapeutics with bispecific antibodies. BioDrugs. 2018; 32(5):441-64. [DOI:10.1007/s40259-018-0299-9] [PMID]
7.Baeuerle PA, Reinhardt C. Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Research. 2009; 69(12):4941-4. [DOI:10.1158/0008-5472.CAN-09-0547] [PMID]
8.Nagorsen D, Baeuerle PA. Immunomodulatory therapy of cancer with T cell-engaging BiTE antibody blinatumomab. Experimental Cell Research. 2011; 317(9):1255-60. [DOI:10.1016/j.yexcr.2011.03.010] [PMID]
9.Löffler A, Kufer P, Lutterbüse R, Zettl F, Daniel PT, Schwenkenbecher JM, et al. A recombinant bispecific single-chain antibody, CD19 × CD3, induces rapid and high lymphoma-directed cytotoxicity by unstimulated T lymphocytes. Blood. 2000; 95(6):2098-103. [DOI:10.1182/blood.V95.6.2098] [PMID]
10.Portell CA, Wenzell CM, Advani AS. Clinical and pharmacologic aspects of blinatumomab in the treatment of B-cell acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 2013; 5(Suppl 1):5-11. [DOI:10.2147/CPAA.S42689] [PMID]
11.Baracho GV, Miletic AV, Omori SA, Cato MH, Rickert RC. Emergence of the PI3-kinase pathway as a central modulator of normal and aberrant B cell differentiation. Current Opinion in Immunology. 2011; 23(2):178-83. [DOI:10.1016/j.coi.2011.01.001] [PMID]
12.Dreier T, Lorenczewski G, Brandl C, Hoffmann P, Syring U, Hanakam F, et al. Extremely potent, rapid and costimulation-independent cytotoxic T-cell response against lymphoma cells catalyzed by a single-chain bispecific antibody. International Journal of Cancer. 2002; 100(6):690-7. [DOI:10.1002/ijc.10557] [PMID]
13.Kischel P, Guillonneau F, Dumont B, Bellahcène A, Stresing V, Clézardin P, et al. Cell membrane proteomic analysis identifies proteins differentially expressed in osteotropic human breast cancer cells. Neoplasia. 2008; 10(9):1014-20. [DOI:10.1593/neo.08570] [PMID]
14.Brandl C, Haas C, d'Argouges S, Fisch T, Kufer P, Brischwein K, et al. The effect of dexamethasone on polyclonal T cell activation and redirected target cell lysis as induced by a CD19/CD3-bispecific single-chain antibody construct. Cancer Immunology, Immunotherapy. 2007; 56(10):1551-63. [DOI:10.1007/s00262-007-0298-z] [PMID]
15.Celik E, Calık P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnology Advances. 2012; 30(5):1108-18. [DOI:10.1016/j.biotechadv.2011.09.011] [PMID]
16.McAtee AG, Templeton N, Young JD. Role of Chinese hamster ovary central carbon metabolism in controlling the quality of secreted biotherapeutic proteins. Pharmaceutical Bioprocessing. 2014; 2(1):63-74. https://www.vanderbilt.edu/younglab/pdf/mcatee14.pdf
17.Baldi L, Hacker DL, Adam M, Wurm FM. Recombinant protein production by large-scale transient gene expression in mammalian cells: State of the art and future perspectives. Biotechnology Letters. 2007; 29(5):677-84. [DOI:10.1007/s10529-006-9297-y] [PMID]
18.Wurm F, Bernard A. Large-scale transient expression in mammalian cells for recombinant protein production. Current Opinion in Biotechnology. 1999; 10(2):156-9. [DOI:10.1016/S0958-1669(99)80027-5] [PMID]
19.Wang Q, Chen Y, Park J, Liu X, Hu Y, Wang T, et al. Design and production of bispecific antibodies. Antibodies. 2019; 8(3):43. [DOI:10.3390/antib8030043] [PMID]
20.Demain AL, Vaishnav P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnology Advances. 2009; 27(3):297-306. [DOI:10.1016/j.biotechadv.2009.01.008] [PMID]
21.Humphreys DP. Production of antibodies and antibody fragments in Escherichia coli and a comparison of their functions, uses and modification. Current Opinion in Drug discovery & Development. 2003; 6(2):188-96. [PMID]
22.Mack M, Riethmüller G, Kufer P. A small bispecific antibody construct expressed as a functional single-chain molecule with high tumor cell cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1995; 92(15):7021-5. [DOI:10.1073/pnas.92.15.7021] [PMID]
23.Kuo SR, Wong L, Liu JS. Engineering a CD123xCD3 bispecific scFv immunofusion for the treatment of leukemia and elimination of leukemia stem cells. Protein Engineering, Design & Selection. 2012; 25(10):561-9. [DOI:10.1093/protein/gzs040] [PMID]
24.Root AR, Cao W, Li B, LaPan P, Meade C, Sanford J, et al. Development of PF-06671008, a highly potent anti-P-cadherin/anti-CD3 bispecific DART molecule with extended half-life for the treatment of cancer. Antibodies. 2016; 5(1):6. [DOI:10.3390/antib5010006] [PMID]
25.De Nardis C, Hendriks LJA, Poirier E, Arvinte T, Gros P, Bakker ABH, et al. A new approach for generating bispecific antibodies based on a common light chain format and the stable architecture of human immunoglobulin G1. Journal of Biological Chemistry. 2017; 292(35):14706-17. [DOI:10.1074/jbc.M117.793497] [PMID]
26.Hoffmann P, Hofmeister R, Brischwein K, Brandl C, Crommer S, Bargou R, et al. Serial killing of tumor cells by cytotoxic T cells redirected with a CD19-/CD3-bispecific single-chain antibody construct. International Journal of Cancer. 2005; 115(1):98-104. [DOI:10.1002/ijc.20908] [PMID]