مقدمه
بیماری سلیاک نوعی بیماری خودایمنی مزمن دائمی در روده کوچک است که در اثر مصرف پروتئین گلوتن و درنتیجه عدم‌‌تحمل این آنتی‌ژن غذایی در افراد مستعد ازنظر ژنتیکی رخ می‌دهد [1]. مصرف گلوتن مسئول اصلی بروز علائم و نشانه‌های بالینی در بیماری سلیاک می‌باشد. در هنگام مواجهه افراد مستعد با گلوتن، آنزیم ترنس گلوتامیناز بافتی منجر به تغییر در این پروتئین می‌شود. درنتیجه یک واکنش التهابی در اثر میان‌کنش بین سیستم ایمنی و بافت روده کوچک ایجاد می‌شود که این واکنش در مخاط روده، عامل ایجاد آتروفی پرزهای روده، کریپت هایپر پلازیا، افزایش تعداد لنفوسیت‌ها در لامینا پروپریا و سندرم سوء‌جذب می‌باشد. در حال حاضر حذف گلوتن از رژیم غذایی، تنها درمان موجود در بیماری سلیاک است [2]. رژیم غذایی بدون گلوتن منجر به بهبودی در علائم و نشانه‌های بالینی بیماری سلیاک، آسیب مخاطی روده کوچک و یکپارچگی اپیتلیال روده می‌شود [3]. 
شیوع بیماری سلیاک هر ساله رو به افزایش است و مکانیسم اساسی این اختلال به‌طور کامل شناخته نشده است. معمولاً بیماری سلیاک در اوایل دوران کودکی پس از درمعرض قرار گرفتن فرد با گلوتن ظاهر می‌شود؛ بااین‌حال، تعداد افراد مبتلا به بیماری سلیاک که این بیماری را در اوایل و اواخر دوران بزرگسالی تجربه می‌کنند نیز در حال افزایش می‌باشند [4]. به همین دلیل، فاکتورهای محیطی دیگری نیز می‌توانند در گسترش این بیماری نقش داشته باشند [5]. از این فاکتورهای محیطی می‌توان مدت‌زمان کوتاه شیردهی، عفونت‌های روده و تغییرات در میکروبیوتای گوارشی را نام برد [6]. میکروبیوتای گوارشی شامل تعداد بسیار زیادی از گونه‌های میکروبی می‌باشد و تعداد ژن‌های آن 150 برابر ژن‌های ژنوم میزبان است و دارای  نقش بسیار مهمی در سلامتی انسان می‌باشد و در عملکردهای مهم میزبان مانند سوخت‌وساز بدن و فیزیولوژیک آن دخالت دارد [7]. 
در رابطه با نقش میکروبیوتای گوارشی در بیماری سلیاک مطالعات اندکی انجام شده است؛ بااین‌حال، نشان داده شده است که تغییر در میکروبیوتای گوارشی-ناتراز شدن یک فاکتور محیطی مهم در بیماری‌زایی یا پاتوژنز بیماری سلیاک می‌باشد [8]. میکروبیوتای گوارشی در ایجاد بلوغ ایمنی در بدن و حالت هموستازیس در روده نقش بسیار مهمی دارد. ناتراز شدن در میکروبیوتای گوارشی ممکن است بر هموستازیس روده تأثیر بگذارد و درنتیجه منجر به پاسخ ایمنی بدن به آنتی‌ژن‌های غذایی مانند گلوتن شود [9]. اغلب مطالعات نشان می‌دهند که ناتراز شدن در میکروبیوتای گوارشی افراد مبتلا به بیماری سلیاک با بیماری فعال به‌صورت کاهش قابل‌توجهی در جمعیت باکتری‌های گرم مثبت مفید مانند بیفیدوباکتریوم و لاکتوباسیلوس در نمونه‌های اثنی‌عشر و مدفوع رخ می‌دهد؛ این کاهش، شرایط مناسبی را جهت کلونیزاسیون باکتری‌های گرم منفی بیماری‌زا در سطوح مخاطی در بیماران سلیاکی فراهم می‌سازد [10].
 همچنین نتایج حاصل از مطالعاتی که بر روی نمونه اثنی‌عشر بیماران سلیاکی صورت گرفته است، نشان می‌دهد که جمعیت بیفیدوباکتریوم در این بیماران کاهش پیدا کرده است [1]. حضور خانواده بیفیدوباکتریا در مجاری گوارشی منجر به اثرات مفیدی در سلامتی فرد ازجمله ایجاد مقاومت در میزبان در برابر عوامل بیماری‌زا می‌شود [11]. علاوه‌براین، مطالعاتی که در کودکان مبتلا به سلیاک انجام شده است، کاهش نسبت لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم به باکتریوئیدس را نیز نشان می‌دهد [12]. سویه‌های مختلفی از گونه‌های لاکتوباسیلوس اثرات القایی بیشتری نسبت به اثرات سرکوبگر، بر هر 2 سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی بدن اعمال می‌کند. سویه‌هایی از لاکتوباسیلوس کازئی منجر به افزایش هر 2 پاسخ موضعی و سیستمیک با واسطه سلول‌های تی به گلوتن می‌شوند [13]. 
باتوجه‌به اهمیت میکروبیوتای روده‌ای در بیماری‌زایی بیماری سلیاک و ناتراز شدن در میکروبیوتای روده‌ای افراد مبتلا به این بیماری، مطالعه حاضر با هدف بررسی تراز 2 میکروب مفید لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم در نمونه مدفوعی بیماران مبتلا به سلیاک نسبت به افراد سالم انجام شده است.
مواد و روش‌ها
این مطالعه آزمایش-کنترل از مرداد 1398 تا بهمن 1398 بر روی20 فرد مبتلا به بیماری سلیاک تحت‌رژیم غذایی فاقد گلوتن به‌عنوان گروه آزمایش و 20 فرد سالم به‌عنوان گروه کنترل مراجعه‌کننده به درمانگاه سلیاک مرکز تحقیقات بیماری‌های گوارش و کبد دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی شهید بهشتی انجام شد. کلیه شرکت‌کنندگان در این مطالعه در جریان اهداف این طرح تحقیقاتی قرار گرفته‌اند. تمام بیماران مبتلا به سلیاک شرکت‌کننده قبل از ورود به مطالعه دارای آنتی‌بادی‌های ضدترانس گلوتامیناز بافتی و اندومیزیوم در سرم خون بودند. همچنین بیماری آن‌ها توسط بافت‌شناسی براساس طبقه‌بندی مارش نیز مورد تأیید قرار گرفت [14].
از شرایط دیگر جهت ورود به مطالعه می‌توان به داشتن حداقل 6 ماه رژیم فاقد گلوتن قبل از ورود به مطالعه اشاره کرد. پیش از شروع، فرم رضایت‌نامه توسط هریک از شرکت‌کنندگان تکمیل و تأیید شده بود. شرایط خروج از مطالعه موارد زیر بوده است: زنان باردار مبتلا به سلیاک، افراد دارای بیماری‌های گوارشی مانند کرون وکولیت زخمی یا کولیت اولسروز یا پس‌-روده‌ آماس زخمی، افرادی دارای سندرم روده کوتاه، افرادی که مصرف مشروبات الکلی داشته‌اند و یا افرادی که وابستگی به مواد مخدر غیرقانونی داشته‌اند، افرادی که سابقه عمل جراحی دهان و معده داشته‌اند، افراد دارای سرطان و یا ازنظر ویروس اچ آی وی مثبت باشند، افرادی که 4 هفته قبل از مطالعه سابقه مصرف داروهای استروئیدی، آنتی‌بیوتیک و داروهای ضدالتهابی غیراستروئیدی داشته‌اند و افرادی که ازنظر بالینی ناهنجاری در میزان اوره، الکترولیت، کراتینین یا کبد سرم داشته‌اند. 
اطلاعات جمعیت‌شناختی افراد شرکت‌کننده شامل سن، جنس و نتیجه پاتولوژی بیماران براساس طبقه‌بندی مارش و نیز پرسش‌نامه تنظیم و ثبت شد. قبل از شروع (روز صفر) و در طول مطالعه نمونه مدفوع از 2 گروه بیماران و کنترل درون ظروف پلاستیکی مخصوص دریافت و جمع‌آوری شد و تا زمان تحلیل در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
استخراج و اندازه‌گیری غلظت AND
 دی‌ان‌ای باکتریایی نمونه‌های مدفوع افراد مورد مطالعه، توسط کیت استخراج دی‌ان‌ای از مدفوع و مطابق با دستورالعمل گفته‌شده در این کیت استخراج شد. به‌طور خلاصه، 200 میلی‌گرم از مدفوع در یک تیوپ استریل، حاوی 300 میکرولیتر از بافر SDE1 و 20 میکرولیتر پروتئیناز K (10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) قرار گرفت و بقیه پروتکل نیز مطابق توضیحات سازنده کیت انجام شد. بعد از استخراج دی‌ان‌ای، خلوص و غلظت آن با اندازه‌گیری نسبت جذب A280/A260 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر  نانودراپ ترمو آمریکا اندازه‌گیری شد. درصورتی‌که نسبت جذب 260 به 280 بین 1/7 تا 2 باشد، دی‌ان‌ای از خلوص کافی برای انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برخوردار می‌باشد [15]. دی‌ان‌ای استخراج شده در دمای 80- درجه سانتی‌گراد ذخیره شد. 2 کاندید باکتریایی ، لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم مورد بررسی قرار گرفتند.
تجزیه‌وتحلیل میکروبیوتای روده‌ای توسط تکنیک ریل تایم پی سی آر
جهت انجام تکنیک ریل تایم پی‌سی‌آر برای شناسایی و سنجش تعداد کپی‌های ژن  آر ان ای ریبوزومی 16 سوودبرگ  (16S rRNA gene) مربوط به گونه‌های بیفیدوباکتریوم و تعیین تعداد این باکتری در میکروبیوتای روده از آغازگرهای (پرایمر) اختصاصی Bifid-F با توالی الیگونوکلئوتیدی´-GGGATGCTGGTGTGGAAGAG-3´-´5 و Bifid-R با توالی الیگونوکلئوتیدی 5´-TGCTCGCGTCCACTATCCAG-3´ و برای گونه‌های لاکتوباسیلوس نیز از پرایمرهای اختصاصی Lacto-F با توالی الیگونوکلئوتیدی 5´-TGGATGCCTTGGCACTAG-3´ و Lacto-R با توالی الیگونوکلئوتیدی 5´-AAATCTCCGGATCAAAGCTTAC-3´  [16] استفاده شد. از دستگاه ترموسایکلر روتورژن-کیو کیاژن و سایبر گرین مستر میکس استفاده شد و تکثیر دی‌ان‌ای در حجم نهایی20 میکرولیتر انجام شد. مقدار اجزای واکنش شامل 10 میکرولیتر از مستر میکس و 10 نانومولار از هریک از آغازگرهای رفت و برگشت و 2 میکرولیتر از دی‌ان‌ای استخراج‌شده محاسبه شد. 
برنامه ریل تایم پی‌سی‌آر برای هر تکثیر به‌صورت دمای دناتوراسیون اولیه 95 درجه سانتی‌گراد برای 15 دقیقه، 40 سیکل با برنامه: دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد برای 20 ثانیه، اتصال آغازگرها با دمای 56 درجه سانتی‌گراد برای 30 ثانیه، طویل شدن در دمای 72 درجه سانتی‌گراد برای 20 ثانیه بود که با مرحله منحنی ذوب باتوجه‌به دستورالعمل دستگاه دنبال شد. بعد از انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بازه دمایی 52 درجه سانتی‌گراد تا 95 درجه سانتی‌گراد به‌منظور تعیین دمای ذوب و خوانش متوالی با گرادیان دمایی 0/5 درجه سانتی‌گراد لحاظ شد.
 تجزیه‌وتحلیل منحنی ذوب جهت تأیید ویژگی کثیر انجام شد. غلظت آغازگرها و برنامه‌های ترموسایکلر برای هریک از واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز خاص بهینه‌سازی شد. منحنی استاندارد برای تعیین تعداد کپی ژن  آران‌ای ریبوزومی 16 سوودبرگ هرکدام از باکتری‌های کاندید با تولید یک سری رقیق 10 برابر از 101 تا 1010 نسخه ژن آران‌ای ریبوزومی 16 سوودبرگ در هر واکنش با استفاده از دی‌ان‌ای سویه اشریشیا کلی انجام شد. تعداد نسخه ژن 16S rRNA در گروه از باکتری‌های کاندید در نمونه‌های مدفوع با مقایسه مقادیر سیکل آستانه نمونه‌ها با منحنی‌های استاندارد تعیین شد. تمام واکنش‌ها با 3 تکرار مجزا گرفت.
تجزیه‌وتحلیل داده‌ها
تجزیه‌وتحلیل آماری با استفاده از نسخه 21 نرم‌افزار آماری SPSS انجام شد. تفاوت در معیارهای جمعیت‌شناختی بین گروه‌های مورد مطالعه با استفاده از آزمون کای‌اسکوئر پیرسون برای متغیرهای دسته‌ای مورد ارزیابی قرار گرفت. مقایسه بین 2 گروه مختلف توسط آزمون تی انجام شد. نتایج به‌دست آمده به‌صورت میانگین±انحراف‌معیار بیان شد. در تمام موارد، سطح معناداری آزمون‌ها کمتر از 5 درصد گرفته شده است. تمام تجزیه‌وتحلیل‌ها برای فراوانی میکروبیوتای روده براساس تعداد سیکل آستانه ارزیابی شد. 
یافته‌ها
مشخصات جمعیت‌شناختی در 2 گروه بیماران مبتلا به سلیاک تحت‌رژیم غذایی فاقد گلوتن و سالم با مقدار احتمال P مرتبط به‌طور کامل مطالعه و تحلیل آماری شدند. شمارش میکروبیوتای روده‌ای در 20 فرد مبتلا به بیماری سلیاک شامل 9 مرد و 11 زن که قبل از ورود به مطالعه و همچنین در طول مطالعه تحت‌رژیم درمانی فاقد گلوتن قرار داشتند، به‌عنوان گروه آزمایش و نیز 20 فرد سالم فاقد سلیاک شامل 10 مرد و 10 زن به‌عنوان گروه کنترل ازنظر ترکیب مورد بررسی قرار گرفتند. ازنظر جنسیتی و میانگین سنی افراد در 2 گروه مورد مطالعه از لحاظ آماری اختلاف معناداری نشان ندادند (تصویر شماره 1). 
 

References
1.Nadal I, Donant E, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. Imbalance in the composition of the duodenal microbiota of children with coeliac disease. Journal of Medical Microbiology. 2007; 56(Pt 12):1669-74. [DOI:10.1099/jmm.0.47410-0] [PMID]
2.Di Sabatino A, Corazza GR. Coeliac disease. Lancet. 2009; 373(9673):1480-93. [DOI:10.1016/S0140-6736(09)60254-3] [PMID]
3.Kaukinen K, Lindfors K, Collin P, Koskinen O, Mäki M. Coeliac disease-a diagnostic and therapeutic challenge. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2010; 48(9):1205-16. [DOI:10.1515/cclm.2010.241] [PMID]
4.Catassi C, Kryszak D, Bhatti B, Sturgeon C, Helzlsouer K, Clipp SL, et al. Natural history of celiac disease autoimmunity in a USA cohort followed since 1974. Annals of Medicine. 2010; 42(7):530-8. [DOI:10.3109/07853890.2010.514285] [PMID]
5.Sanz Y, De Pama G, Laparra M. Unraveling the ties between celiac disease and intestinal microbiota. International Reviews of Immunology. 2011; 30(4):207-18. [DOI:10.3109/08830185.2011.599084] [PMID]
6.Ghosh S. Advances in our understanding of the pathogenesis of celiac disease. Canadian Journal of Gastroenterology . 2011; 25(4):186. [DOI:10.1155/2011/684230] [PMID] [PMCID]
7.Guarner F, Malagelada JR. Gut flora in health and disease. Lancet. 2003; 361(9356):512-9. [DOI:10.1016/S0140-6736(03)12489-0] [PMID]
8.Cristofori F, Indrio F, Miniello VL, De Angelis M, Francavilla R. Probiotics in celiac disease. Nutrients. 2018; 10(12):1824. [DOI:10.3390/nu10121824] [PMID] [PMCID]
9.Nakayama J, Kobayashi T, Tanaka S, Korenori Y, Tateyama A, Sakamoto N, et al. Aberrant structures of fecal bacterial community in allergic infants profiled by 16S rRNA gene pyrosequencing. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2011; 63(3):397-406. [DOI:10.1111/j.1574-695X.2011.00872.x] [PMID]
10.Collado MC, Donat E, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. Specific duodenal and faecal bacterial groups associated with paediatric coeliac disease. Journal of Clinical Pathology. 2009; 62(3):264-9. [DOI:10.1136/jcp.2008.061366] [PMID]
11.Davis CD, Milner JA. Gastrointestinal microflora, food components and colon cancer prevention. The Journal of Nutritional Biochemistry. 2009; 20(10):743-52. [DOI:10.1016/j.jnutbio.2009.06.001] [PMID] [PMCID]
12.Ou G, Hedberg M, Horstedt P, Baranov V, Forsberg G, Drobni M,et al. Proximal small intestinal microbiota and identification of rod-shaped bacteria associated with childhood celiac disease. The American Journal of Gastroenterology. 2009; 104(12):3058-67. [DOI:10.1038/ajg.2009.524] [PMID]
13.Sanders ME. Impact of probiotics on colonizing microbiota of the gut. Journal of Clinical Gastroenterology. 2011; 45(S):S115-9. [DOI:10.1097/MCG.0b013e318227414a] [PMID]
14.Marsh MN, Johnson MW, Rostami K. Mucosal histopathology in celiac disease: A rebuttal of Oberhuber’s sub-division of Marsh III. Gastroenterology and Hepatology from Bed to Bench. 2015; 8(2):99-109. [PMID]
15.Chen H, Rangasamy M, Tan SY, Wang H, Siegfried BD. Evaluation of five methods for total DNA extraction from western corn rootworm beetles. PLoS One. 2010; 5(8):e11963. [DOI:10.1371/journal.pone.0011963] [PMID] [PMCID]
16.Wang IK, Lai HC, Yu CJ, Liang CC, Chang CT, Kuo HL, et al. Real-time PCR analysis of the intestinal microbiotas in peritoneal dialysis patients. Applied and environmental microbiology. 2012; 78(4):1107-12. [DOI:10.1128/AEM.05605-11] [PMID] [PMCID]
17.Marasco G, Di Biase AR, Schiumerini R, Eusebi LH, Iughetti L, Ravaioli F, et al. Gut microbiota and celiac disease. Digestive Diseases and Sciences. 2016; 61(6):1461-72. [DOI:10.1007/s10620-015-4020-2] [PMID]
18.Aureli P, Capurso L, Castellazzi AM, Clerici M, Giovannini M, Morelli L, et al. Probiotics and health: An evidence-based review. Pharmacological Research. 2011; 63(5):366-76. [DOI:10.1016/j.phrs.2011.02.006] [PMID]
19.Harnett J, Myers SP, Rolfe M. Probiotics and the microbiome in celiac disease: A randomised controlled trial. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016; 2016:9048574. [DOI:10.1155/2016/9048574] [PMID] [PMCID]
20.Grover S, Rashmi HM, Srivastava AK, Batish VK. Probiotics for human health -new innovations and emerging trends. Gut pathogens. 2012; 4(1):15. [DOI:10.1186/1757-4749-4-15] [PMID] [PMCID
21.Sanz Y, Sanchez E, Marzotto M, Calabuig M, Torriani S, Dellaglio F. Differences in faecal bacterial communities in coeliac and healthy children as detected by PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2007; 51(3):562-8. [DOI:10.1111/j.1574-695X.2007.00337.x] [PMID]
22.Golfetto L, Duarte de Senna F, Hermes J, Beserra BTS, Franca F, Martinello F. Lower bifidobacteria counts in adult patients with celiac disease on a gluten-free diet. Arquivos de Gastroenterologia. 2014; 51(2):139-43. [DOI:10.1590/S0004-28032014000200013] [PMID]
23.Moraes LF, Grzeskowiak LM, Teixeira TF, Gouveia Peluzio M. Intestinal microbiota and probiotics in celiac disease. Clinical Microbiology Reviews. 2014; 27(3):482-9. [DOI:10.1128/CMR.00106-13] [PMID] [PMCID]
24.Nistal E, Caminero A, Vivas S, Ruiz de Morales JM, Saenz de Miera LE, Rodriguez-Aparicio LB, et al. Differences in faecal bacteria populations and faecal bacteria metabolism in healthy adults and celiac disease patients. Biochimie. 2012; 94(8):1724-9. [DOI:10.1016/j.biochi.2012.03.025] [PMID]
25.Abdullah GA, Jamalludeen NM, Mansour AA. The role of probiotics in celiac disease and their potential effect on immunological and clinical markers of the disease. International Journal of Scientific & Engineering Research. 2017; 8(9):1347-73. [Link]
26.Di Biase AR, Marasco G, Ravaioli F, Dajti E, Colecchia L, Righi B, et al. Gut microbiota signatures and clinical manifestations in celiac disease children at onset: A pilot study. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2021; 36(2):446-54. [DOI:10.1111/jgh.15183] [PMID]
27.Sanchez E, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. Intestinal Staphylococcus spp. and virulent features associated with coeliac disease. Journal of Clinical Pathology. 2012; 65(9):830-4. [DOI:10.1136/jclinpath-2012-200759] [PMID]
28.Collado MC, Donat E, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. Imbalances in faecal and duodenal Bifidobacterium species composition in active and non-active coeliac disease. BMC Microbiology. 2008; 8:232. [DOI:10.1186/1471-2180-8-232] [PMID] [PMCID]
29.De Meij TG, Budding AE, Grasman ME, Kneepkens CM, Savelkoul PH, Mearin ML. Composition and diversity of the duodenal mucosa-associated microbiome in children with untreated coeliac disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 2013; 48(5):530-6. [DOI:10.3109/00365521.2013.775666] [PMID]
30.Schippa S, Iebba V, Barbato M, Di Nardo G, Totino V, Checchi MP, et al. A distinctive ‘microbial signature’ in celiac pediatric patients. BMC Microbiology. 2010; 10:175. [DOI:10.1186/1471-2180-10-175] [PMID] [PMCID]
31.Olivares M, Neef A, Castillejo G, Palma GD, Varea V, Capilla A, et al. The HLA-DQ2 genotype selects for early intestinal microbiota composition in infants at high risk of developing coeliac disease. Gut. 2015; 64(3):406-17. [DOI:10.1136/gutjnl-2014-306931] [PMID]
32.De Palma G, Nadal I, Collado MC, Sanz Y. Effects of a gluten-free diet on gut microbiota and immune function in healthy adult human subjects. The British Journal of Nutrition. 2009; 102(8):1154-60. [DOI:10.1017/S0007114509371767] [PMID]
33.Nylund L, Hakkola S, Lahti L, Salminen S, Kalliomäki M, Yang B, et al. Diet, perceived intestinal well-being and compositions of fecal microbiota and short chain fatty acids in oat-using subjects with celiac disease or gluten sensitivity. Nutrients. 2020; 12(9):2570.[DOI:10.3390/nu12092570] [PMID] [PMCID]
34.Chander AM, Yadav H, Jain S, Bhadada SK, Dhawan DK. Cross-talk between gluten, intestinal microbiota and intestinal mucosa in Celiac disease: Recent advances and basis of autoimmunity. Frontiers in Microbiology. 2018; 9:2597. [DOI:10.3389/fmicb.2018.02597] [PMID] [PMCID]